pegfpn1il10hgf真核表达载体的构建及在t6细胞中的表达-construction of peg fp n1 il 10 hgf eukaryotic expression vector and its expression in t6 cells.docxVIP

pEGFP-N1-IL10-HGF 真核表达载体的构建及在 T6 细胞中的表达 中 文 摘 要目的 构建含增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescence Protein， EGFP）基因和白细胞介素 10（Interleukin 10，IL10）-肝细胞生长因子（Hepatocyte Growth Factor，HGF）重组融合基因的真核表达载体 pEGFP-N1-IL10-HGF，验证其在 T6 大鼠肝星状细胞中的表达。方法 从人单核细胞中提取总 RNA，RT-PCR 扩增 IL10 基因编码区序列，以克隆 载体 pUC-SRα/HGF 为模板 PCR 扩增 HGF 基因编码区序列，将二者纯化片段连接 进入 pGEM-T-Easy 克隆载体，转化 Top10 感受态大肠杆菌，氨苄青霉素及蓝白斑 筛选,酶切及 DNA 测序鉴定得到阳性克隆。以上述克隆载体为模板采用重组 PCR 技术扩增得到 IL10-HGF（LH）融合基因序列，将纯化片段连接进入 pGEM-T-Easy 克隆载体，氨苄青霉素及蓝白斑筛选,酶切及 DNA 测序鉴定得到阳性克隆。双酶 切定向克隆构建 pEGFP-N1-LH，转化 Top10 感受态大肠杆菌，卡那霉素筛选，酶 切及 DNA 测序鉴定得到阳性克隆。提取 pEGFP-N1-LH 及 pEGFP-N1 质粒；采用脂质 体介导法瞬时转染 T6 细胞，G418 筛选获得真核载体稳定表达细胞系，荧光显微镜 观察增强型绿色荧光蛋白亚细胞定位， RT-PCR 及 Western 验证 LH 基因转录及 蛋白表达。结果 酶切与测序证实克隆质粒中含有 IL10、HGF、LH 基因编码区；酶切和测序 证实重组真核表达质粒中含有 LH 融合基因编码区序列且插入方向正确；荧光显 微镜观察转染了 pEGFP-N1 和 pEGFP-N1-LH 的 T6 细胞中可以看到增强型绿色荧光 蛋白的表达，EGFP 亚细胞定位在全细胞，LH 主要定位在细胞质，RT-PCR 及 Western 结果表明重组 LH 在 T6 细胞中稳定表达。结论 成功克隆了 IL10、HGF 及 LH 基因编码区序列，构建了以增强型绿色荧光 蛋白为报告基因的重组真核表达载体 pEGFP-N1-LH，pEGFP-N1-LH 在 T6 细胞中稳 定表达成功。本课题由湖南省卫生厅课题基金(No.B2003-086);湖南省自然科学基金(No.07JJ6163)资助完成.关键词白细胞介素-10肝细胞生长因子基因克隆融合基因增强型绿色荧光蛋白T6 细胞Construction of Eukaryotic Expression PlasmidpEGFP-N1-IL10-HGF and Its Expression in T6 CellsAbstractObjective To construct eukaryotic express plasmid pEGFP-N1-IL10-HGF containing human IL10-HGF（LH） recombinant fusion gene and enhanced green fluorescence protein gene ,and to confirm its expression in T6 rat hepatic stellatecells.MethodsIL10 cDNA was amplified by RT-PCR from human mononuclear cells, HGF cDNA was amplified by PCR from pUC-SRα/HGF vector, purified fragments were cloned into pGEM-T-Easy vector,recombinant clones were selected byampicillin and blue-white spot, and then indentfied by digestion analysis and DNA sequencing. LH cDNA was amplified by recombinant PCR from pGEM-T-Easy-IL10 and pGEM-T-Easy-HGF vector, Purified fragments was cloned into pGEM-T-Easyvector，recombinant clones were selected by ampicillin and blue-white spot, and thenindentfied by digestion analysis and DNA se