pi3kakt和mekerk通路调控h3k27me3甲基化酶和去甲基化酶基因表达的分析-analysis of pi 3 kakt and mekerk pathway regulating h3 k27 me 3 methylase and demethylase gene expression.docx

Histone H3 lysine 27 Methylase and Demethylase Genes Expressinon Regulated by PI3K/AKT and MEK-ERK pathwayShiheziUniversityIn Fulfillment of the Requirements for the Degree ofDoctor of AgricultureBy Li Jing(Animal Genetics and Breeding)Dissertation Supervisor: Prof. Liu Shou RenJune, 2013 Shihezi, Xinjiang, China石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果.据 我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的 研究成果.对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表 示谢意.研究生签名:李品时间:‘必 8年 6 月 2 日使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文 并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版.有权将学位论文在学校图书 馆保存并允许被查阅.有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务. 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版.保密的学位论文在解密后适用本规定.研究生签名 :J揄导附:在\ r时间: )叫主年 j 月号日时间:沪也年 4 月仨日中文摘要组蛋白甲基化是一种重要的表观遗传修饰，参与基因的表达调控。组蛋白 H3K27me3 是抑制基因转录的表观遗传修饰标记之一，可以抑制靶基因的转录。目前研究发现，组 蛋白 H3K27me3 受组蛋白甲基化酶和去甲基化酶的调控。其中，Zester 同源增强子 2 是 组蛋白 H3K27 甲基化转移酶，EZH1 是它的同源物，它们都是 Polycomb 蛋白家族的成 员。UTX 和 JMJD3 是组蛋白 H3K27me3 去甲基化酶。PI3K/AKT 信号通路对组蛋白甲 基化酶 EZH2 基因表达已经有报道，但在成肌细胞分化过程中是否调控组蛋白 H3K27 甲基化酶和去甲基化酶的表达还不清楚，我们用小鼠成肌细胞 C2C12 为研究材料，采 用免疫印迹、染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation，CHIP)、定量 PCR（Q-PCR）的方法研究 PI3K/AKT 信号通路在成肌细胞分化阶段对组蛋白 H3K27 甲基 化酶 EZH1/EZH2 和去甲基化酶 UTX/JMJD3 的表达调控。此外，在多种肿瘤组织中检 测到 EZH2 存在过表达的现象，UTX 和 JMJD3 也被检测到发生突变或者表达下降。 MEK/ERK 信号通路是生物体内广泛存在的一条信号通路，参与调控细胞的生长、增殖、 分化和凋亡等生命过程。在某些癌症细胞中， MER/ERK 信号通路参与调控 EZH2 基因 的表达。为了进一步研究这条通路对组蛋白甲基化酶和去甲基化酶的调控。我们以 C2C12、C127、NIH3T3、HEPA1-61-6、RD 五种细胞系为研究对象，用 RT-PCR 和 Western- Bloting 方法分析检测 MER-ERK 信号通路对组蛋白 H3K27 甲基化酶 EZH2/EZH1 基因 和去甲基化酶 UTX/JMJD3 基因的表达。结果如下：磷酸化的 AKT 在成肌细胞分化过程中逐渐升高，EZH1 和 JMJD3 蛋白表达变化不 明显，EZH2 蛋白表达降低，到第 6 和第 7d 蛋白降到最低值，UTX 蛋白表达升高。成肌细胞分化过程中用 PI3K/AkT 信号通路激活剂处理 24h 后，Myogenin 和 MCK 蛋白表达升高，H3K27me3 在 Myogenin 基因启动子区和 MCK 基因启动子及增强子区 的富集与对照组相比降低。UTX 蛋白表达略微升高，JMJD3、EZH1 和 EZH2 蛋白与对 照相比变化不明显。用 PI3K/AKT 号通路抑制剂处理 24h 后，Myogenin 和 MCK 蛋白表 达降低，H3K27me3 在 Myogenin 基因启动子区和 MCK 基因启动子及增强子区的富集 与对照组相比升高， UTX 和 EZH2 蛋白表达均降低，其中 JMJD3 和 EZH1 蛋白表达降低不明显。不同浓度的 MEK/ERK 信号通路抑制剂 U0126（0、10、20、40 umol/L）处理 24h 后，在五种细胞磷酸化的 ERK1/2 表达水平随着浓度的升高逐渐降低；EZH1 和 EZH2 基因 mRNA 表达水平与对