pi3kakt信号通路调控胞内布鲁氏菌16m存活的分子机制研究-molecular mechanism of pi 3 kakt signaling pathway regulating the survival of brucella intracellulare 16m.docx

Study on the molecular mechanism of PI3K/Akt signaling pathway in the regulation of Brucella melitensis 16M survival in cellsA Dissertation Submitted toShihezi Universityfor the Degree ofDoctor of AgricultureByZhang Junbo(Animal Genetics Breeding and Reproduction)Dissertation Supervisor: Prof. Chen ChuangfuNovember, 2014石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除 文中已经注明引用的内容外 ，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究 做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主 管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。 有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编 出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。课题来源973 计划项目 项目名称：布鲁氏菌侵染与胞内寄生的分子机制研究 项目编号： 2010CB530203摘要布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌引发的一种人畜共患传染病。布鲁氏菌能够抑 制细胞的凋亡和促进细胞的自噬，导致布鲁氏菌在吞噬细胞中生存繁殖，它能引起人、 畜多器官损伤和慢性感染，给人类健康和畜牧业和谐发展带来严重威胁。已有研究表明 PI3K/Akt信号通路不仅参与细胞凋亡、自噬等多种细胞活动和生物学效应还与病原体在 细胞内的生存繁殖密切相关，然而，该信号通路否参与了布鲁氏菌在宿主细胞内的生存 繁殖尚鲜有报道，本研究通过探讨PI3K/Akt信号通路对胞内布鲁氏菌生存繁殖的影响及 与布鲁氏菌介导的细胞凋亡、自噬的影响，揭示布鲁氏菌在巨噬细胞内持续性感染的分 子机制，为布鲁氏菌病新药物研发、防治及家畜抗病育种工作奠定基础。目的：（1）检测布鲁氏菌及脂多糖是否激活小鼠巨噬细胞的PI3K/Akt信号通路。（2） 阻断PI3K/Akt信号通路后检测对羊种布鲁氏菌16M生存繁殖在宿主体内外的影响。（3） 阻断PI3K/Akt信号通路后检测对羊种布鲁氏菌16M介导的细胞凋亡的影响。（4）阻断PI3K/Akt信号通路后检测对羊种布鲁氏菌16M介导的细胞自噬的影响。（5）检测PI3K催化亚基p110α在羊种布鲁氏菌16M侵染巨噬细胞过程中的功能。从而揭示布鲁氏菌在 巨噬细胞内持续性感染的分子机制，为布鲁氏菌病新药物研发、防治及家畜抗病育种工 作奠定基础。方法：（1）应用Western blot技术检测：布鲁氏菌16M（16M）、其它菌株和脂多糖 LPS 对 巨 噬 细 胞 内 p-Akt(S473) 和 p-Akt(T308) 表 达 的 影 响 ； 以 及 16M 对 巨 噬 细 胞 内p-Akt(S473)和p-Akt(T308)表达的影响是否与侵染时间和侵染比例有关；PI3K抑制剂2-(4-吗琳基)-8-苯基-4氢-1-苯并毗喃-4酮（LY）对16M介导p-Akt(S473)和p-Akt(T308)表达的 抑制效果。（2）抑制剂LY（LY）与巨噬细胞孵育1h，然后，用16M侵染巨噬细胞，未 经抑制剂LY处理的细胞作为对照组，分别在30min、45min、4h、12h和24h 检测布鲁氏 菌的CFU；用ELISA检测细胞上清液中IFN-γ、IL-12p70和TNF-α的分泌。选取6-8周龄雌 性BALB/c小白鼠（每组10只），腹腔注射抑制剂LY（20mg/kg/day）并持续到实验结束， 给药5天后感染16M，剂量为LD100(4.6×108CFU/0.2mL)和LD50(6.3×107CFU/0.2mL)，统计小鼠的死亡率；感染1×106CFU/0.2mL剂量的16M，取小鼠脾脏和肝脏，计算16M的含 量；利用病理切片技术，观察病理变化。（3）抑制剂LY与巨噬细胞作用1h，然后，用16M 侵染巨噬细胞，未经抑制剂LY处理的细胞作为对照组，利用/c1116.htmcaspase-3、8、9 活性检测 试剂盒检测其活性变化；利用实时定量PCR和Western blot检测凋亡相关基因的表达；利 用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。（4）用慢病毒包装Plex-MSC-EGFP-LC3质粒，转染