pcr熔解曲线法检测hbv基因型及rtarmsqpcr法定量检测hbvymdd突变的建立-detection of hbv genotype by pcr melting curve method and establishment of hbv ymdd mutation by rtarmsqpcr method.docxVIP

PCR 熔解曲线法检测 HBV 基因型及 RT-ARMS-qPCR 法定量检测 HBV YMDD 突变的建立中 文 摘 要目的：1. 建立一种新的乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）基因分型方法，并 应用此方法检测福建省乙肝患者的 HBV 基因型，了解福建省 HBV 基因型的分 布情况，并探讨基因型与肝纤维化、HBeAg 阳性率和 HBV DNA 水平的关系。 2. 构建 HBV 野生型 YMDD 以及突变型 YVDD 的标质粒标准品；建立高灵敏度的 RT-ARMS-qPCR 方法定量检测 YMDD 及 YVDD，并对该方法进行评价， 为 HBV YMDD 耐药突变定量检测奠定基础。方法：1. PCR熔解曲线法检测HBV基因型的建立：根据文献报道的中国HBV B、C 型基因组全序列，分别设计B、C型特异性引物，以HBV B、C型的标准质粒为对 照标准品，建立一种新的基于PCR的熔解曲线法，根据PCR产物的Tm值判断基 因型并经测序验证；评价其灵敏度、特异性及重复性。2. PCR 熔解曲线法检测 HBV 基因型检测效能的评价：分别采用 PCR 熔解 曲线法和市售的 HBV 基因分型试剂盒对 51 例 HBV 感染者进行基因分型，比较 两法的一致性，评价 PCR 熔解曲线法的检测效能。3. PCR 熔解曲线法检测 HBV 基因型的初步临床应用：收集 346 份 HBsAg 阳性标本，利用所建立的 PCR 熔解曲线法检测其基因型，以了解福建省 HBV 基 因型的分布情况，探讨基因型与肝纤维化、HBeAg 阳性率以及 HBV DNA 水平 的关系。4. RT-ARMS-qPCR 法检测 HBV YMDD 耐药突变的建立：以 pMD-18T 为载 体，构建拉米夫定耐药相关的 YMDD 野生株、YVDD 突变株质粒标准品，建立 RT-ARMS-qPCR 的定量标准曲线，并评价检测系统的敏感性、特异性及重复性。 结果：1. 成功建立了 PCR 熔解曲线法检测 HBV 基因型成功建立了检测 HBV 基因型的 PCR 熔解曲线法，可以根据 Tm 值判断 HBV基因型。B 型 Tm 值为 80.79±0.35，C 型 Tm 值为 85.75±0.33；可以对 HBV DNA拷贝数≥103copies/ml 的患者 HBV 进行分型；重复性好，高（108copies/ml）、中（106copies/ml）、低（104copies/ml）浓度血清 Tm 值的批内 CV 值分别为 0.15%、 0.09%、0.16%。2. PCR 熔解曲线法检测 HBV 基因型检测效能的评价对随机选取的 51 例 HBV 感染者进行 HBV 基因分型，PCR 熔解曲线法检测 为 B 型的 14 份标本中，市售 HBV 基因分型试剂盒检出 14 份 B 型；21 份 C 型标 本用市售试剂盒检出全部为 C 型；16 份 B/C 混合型的标本中，市售试剂盒的检 测结果为 1 份 B 型，2 份 C 型，13 份 B/C 混合型。两种方法比较，B 型结果符合 率为 100%，C 型结果符合率为 100%，B/C 混合型结果符合率 81.25%，总体符合 率为 94.12%（48/51，Kappa =0.909，P＜0.05）。3. PCR 熔解曲线法检测 HBV 基因型的初步临床应用3.1 HBV 基因型分布 346 例 HBV 感染者中，检出 B 型 190 例，占 54.91%， C 型 82 例，占 23.70%，B/C 混合型 74 例，占 21.39%，结果显示福建省乙肝患 者中以 B 型 HBV 感染为主。3.2 HBV 基因型与肝纤维化、HBeAg 阳性率以及 HBV DNA 病毒载量关系346 例 HBsAg 阳性的标本中 91 例被确诊为肝纤维化，142 例标本进行了 HBeAg 和 HBV DNA 定量的检测，对其进行基因分型发现，91 例肝纤维化标本中检出 C 型 39 例，占 42.86%（39/91），显著高于 C 基因型在全部研究对象（346 例）中 所占的比例 23.7%（82/346），而检出 B 型 38 例，占 41.76%（38/91），低于 B 基 因型在全部研究对象中所占的比例 54.91%（190/346）；对 142 例 HBV DNA≥ 103copies/ml 的患者血清，进行 HBV 基因分型，结果发现 C 基因型的病毒载量（HBV DNA）明显高于 B 型和 B/C 混合型，且 C 基因型的 HBeAg 阳性率 87.18%（34/39）亦显著高于 B 型 68.35%（54/79）和 B/C 混合型 41.67%（10/24），差 异均有统计学意义（P＜0.05）。以上结果证明 C 基因型与