paas作为sdesaelisa标记酶的表征及其定向进化-characterization and directed evolution of paas as a sdesaerisa marker enzyme.docxVIP

英汉缩略语名词对照英文缩写英文全称中文全称SDESASpectrophotometric-dual-enzyme-simuLtaneous assay单通道双酶同步分析ECAPEscherichia coli alkaline phosphatsae大肠杆菌碱性磷酸酶AChEacetylcholine esterase乙酰胆碱酯酶PAASArylsuLphatase绿脓杆菌芳香硫酸酯酶 4NNPP4-nitro-1-naphthylphosphate4-硝基-1-萘酚磷酸酯 4NNP4-Nitro-1-naphthyl4-硝基-1-萘酚ATChAcetylthiocholine chloride硫代乙酰胆碱DTNB5，5-Dithiobis(2-nitrobenzoic-acid5，5-二硫双(2-硝基苯甲) 4PNS4-nitrophenol potassium4-硝基苯酚硫酸钾4PNPNitrophenol对硝基苯酚1PAAS 作为 SDESA-ELISA 标记酶的表征及其定向进化摘要酶 联 免 疫 吸 附 分 析 (Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay ， ELISA)在临床检验、卫生检验及生物医学基础研究领域应用广泛，但 经典 ELISA 只能测定单组份且效率低。基于快速变换光度计测量波长 能实现光度法双酶同测(spectrophotometric-dual- enzyme-simuLtaneous assay ，SDESA) 。 用 ELISA 基于 SDESA 同 步 测 定 两 组 份 称 SDESA-ELISA，其使分析效率加倍。酶标仪标配滤光片为 405 nm 和 450 nm；SDESA-ELISA 配对标记酶为水解酶并需满足以下条件: (1)标 记酶 A 水解显色底物 A 的最大等吸收波长在 405nm 附近，标记酶 B 所得显色产物 B 的最大差吸收峰在 405 nm 附近；(2)配对标记酶缓冲液 兼容，且比活都足够高；(3)配对标记酶都有良好稳定性；(4)两种标记 酶的显色产物和显色底物对酶活性干扰可忽略。筛选发现 4-硝基-萘基 磷酸酯 (4-nitro-1-naphthy lphosphate， 4NNPP)为底物 A，大肠杆菌碱 性磷酸酶(Escherichia coli alkaline phosphatase， ECAP)活性和稳定性都 满足要求，需筛选与其最适缓冲液相容且显色底物及产物对活性无干 扰的标记酶 B。限于最适 pH，仅乙酰胆碱酯酶（acetylcholine esterase， AChE) 及 绿 脓 杆 菌 芳 香 硫 酸 酯 酶 (Pseudomonasaeruginosa arylsuLphatase，PAAS)为候选标记酶 B。本项目比较 PAAS 和 AChE2与 ECAP 配对进行 SDESA 的有效性和性能差异，并建立 PAAS 定向进化系统。ECAP 和 AChE 组合进行 SDESA 的表征ECAP 水解 4NNPP 产物 4-硝基-1-萘酚(4-Nitro-1-naphthyl，4NNP) 在 450nm 附近有最大差吸收峰波长，在 405nm 附近为最大等吸收波长。 AChE 催化硫代乙酰胆碱(Acetylthiocholine chloride，ATCh)水解后在显 色剂 5，5-二硫双(2-硝基苯甲)（5，5-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)， DTNB）作用下产物为 NTB，在 410nm 左右有最大差吸收峰波长。ECAP 和 AChE 在相同碱性 Tris-HCl 缓冲液中比活和稳定性基本满足要求。 对 ECAP 和 AChE，校正吸收后 SDESA 灵敏度、检测限、线性范围与 单组份测定一致。但 ATCh 稳定性差，不便于配制即开即用试剂盒。ECAP 和 PAAS 组合进行 SDESA 的表征PAAS 催化对硝基苯酚硫酸钾（4-nitrophenol potassium， 4PNS) 水解产物对硝基苯酚(Nitrophenol ，4PNP) 最大差吸收峰在 405nm 左 右。ECAP 和 PAAS 在碱性 DEA-HCl 缓冲液中均表现出其最佳比活； 对 ECAP 和 PAAS 进行 SDESA 的灵敏度、检测限、线性范围与单组份 测定基本一致，且显色底物光谱性质更匹配，显色底物很稳定。野生 型 PAAS 最高比活仅为 39 kU/g，37 度热失活半衰期仅 4 天。为了灵敏 度与单组份 ELISA 相当，PAAS 突变体的活性需提高 20 倍以上且在 37 度 15 天活性保留 85%以上。因此，需对 PAAS 进行分子改造提高活 性和稳定性，才能与碱性磷酸酶组合用于 S