pcr及lamp法牛胚胎性别鉴定的应用分析-application and analysis of pcr and lamp method for sex identification of bovine embryos.docxVIP

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2018-06-01 发布于上海
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pcr及lamp法牛胚胎性别鉴定的应用分析-application and analysis of pcr and lamp method for sex identification of bovine embryos.docx

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pcr及lamp法牛胚胎性别鉴定的应用分析-application and analysis of pcr and lamp method for sex identification of bovine embryos

* 摘要胚胎性别鉴定是胚胎工程技术的重要组成部分之一对家畜育种生产和遗传疾病的防治均有非常重要的意义本论文为建立一种快速可靠易操作的牛胚胎性别鉴定方法做了以下探讨1选用牛 Y 染色体特异序列设计引物建立 PCR 牛胚胎性别鉴定扩增体系分别选择 BOV97M 做公牛特异扩增引物及 1.715 卫星 DNA 做牛特异扩增内标引物在连续多重 PCR 里前 11 个循环只用雄性特异引物扩增之后再加入内标引物继续进行 25 个循环的扩增 BOV97M 引物扩增产物为 141bp 牛卫星 1.715DNA 扩增产物为 216bp 用牛血样 DNA 优化连续多重 PCR 体系该体系的准确率和灵敏度分别为 10066/66 10pg 牛基因组 DNA(约 3 个细胞)由于在扩增过程中暂停循环添加内标引物不仅费时费力而且容易污染故该扩增体系不适宜做为现场牛胚胎性别鉴定试剂盒2 选用牛牙釉蛋白bAML序列设计一对引物建立 PCR 牛胚胎性别鉴定扩增体系该 PCR 体系对母牛 DNA 扩增只有一种产物467bp而对公牛 DNA 的扩增有两种大小不同的产物467bp 341bp本实验从镁离子浓度退火温度酶浓度引物浓度变性剂循环数及反应体积等方面对上述 PCR 系统进行了优化优化体系为50mM KCl 10mM Tris-HCl 0.1% Triton X-1002.0mM MgCl20.25mM/dNTP3U Taq DNA 聚合酶每条引物 20pM共 50 循环前 20 个退火温度为 53后 30 个为 54 反应体积 50ul其准确率和灵敏度分别为 10060/60和 10pg DNA本扩增体系优点在于选用一对引物准确灵敏快速适宜做牛胚胎性别鉴定试剂盒3对日本产品 LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)法牛胚胎性别鉴定试剂盒进行了评价研究运用该试剂盒在实验室及现场鉴定胚胎性别准确率为 10030/30灵敏度为 1pg现场移植符合率为 3/3具有快速准确灵敏易检测等优点不足之处是在高浓度模板500ng时出现假阳性雌性鉴定成雄性非特异扩增无法排除上述实验结果表明LAMP 试剂盒比 PCR 试剂盒更适用于现场牛胚胎性别鉴定4对开发 LAMP 法牛胚胎性别鉴定试剂盒进行了探索性研究设计两组 8 条 LAMP 牛胚胎性别鉴定引物建立了 LAMP 法牛胚胎性别鉴定扩增体系实验中发现在无甜菜碱时LAMP 反应仍获得少量扩增产物DMSO 对 LAMP 有抑制作用同时对引物设计及体系优化进行了研究关键词牛性别鉴定PCR聚合酶链式反应 LAMP(环媒介导恒温扩增法)*.国家863计划奶牛和肉牛胚胎工程高效繁育技术项目基金资助Study on Bovine Embryo Sexing by PCR and LAMP MethodsWu Yang-sheng (biochemistry and molecular biology) Surpervised by Prof. Yu Mei-hui and Dr. Liu Ming-junAbstract Embryo sexing is one of the important parts of embryo engneering techniques, which has played an important role in livestock breeding, reproduction and prevention of genetic diseases. The purpose of this study was to establish a rapid reliable and convenient method for the bovine embryo sexing. For this aim, the main results were as follows:PCR system of bovine embryo sexing was established by using bovine Ychromosome–specific sequence primers. The BOV97M and bovine 1.715 satellite DNA sequences were selected as the primers of male and bovine-specific DNA, respectively. In consecutive and multiplex PCR, the first 11 cycles were done with male