pd l1高表达的间质细胞通过诱导免疫耐受促进肿瘤生长的实验研究-experimental study on promoting tumor growth by inducing immune tolerance in interstitial cells with high expression of pd l1.docxVIP

三峡大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作 所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经 发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明 确方式标明，本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。学位论文作者签名： 日期： 三峡大学研究生知识产权承诺书本人承认：我作为三峡大学硕士研究生在校学习期间，在导师指导下，依据研究 工作所作学位论文的知识产权全部权归三峡大学所有。本人承诺：我有义务维护三峡大学的知识产权，凡是以我本人学位论文内的全部 或部分研究成果，或实验数据为基础所形成的研究论文及成果，无论是以何种形式刊 发学术论文、进行成果鉴定或申报奖励，均以三峡大学为第一作者单位或完成单位， 并事先征得导师或学校相关部门的同意。我愿承担因违背上述承诺而引起的一切法津和经济后果。学位论文作者签名： 日期： 内 容 摘 要目的 前期的实验研究证明一定量的化疗药物，如顺铂处理肿瘤细胞之后，肿 瘤细胞上 PD-L1 的表达水平增高，这也是顺铂对于恶性肿瘤的治疗预后不好的原因 之一。顺铂是不是也可以诱导肿瘤微环境中纤维细胞、血管内皮细胞等的 PD-L1 的 表达量上升导致肿瘤微环境的免疫耐受，使恶性肿瘤继续发生、发展？本研究通过 基因工程技术构建表达 mPDLl 真核表达载体，在 L929 细胞中稳定高表达，通过 PD-L1 转基因细胞的构建及其功能的研究进一步探讨 PD-L1 信号发挥作用的分子机 制及其与肿瘤发生的关系。方法（1）不同浓度的化疗药物 DDP 处理 L929 细胞，流式细胞技术检测 PD-L1 在 L929 细胞上表达水平；（2）PCR 方法扩增得到小鼠的 PD-L1 全长片段，以 pcDNA3.1(+)真核表达质粒为载体，构建得到重组质粒 pcDNA3.1(+)-PD-L1。脂质 体转染法将重组质粒转染到小鼠成纤维细胞（L929），通过 G418 筛选得到高表达 PD-L1 的稳定细胞株并经逆转录聚合酶链反应（Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）、细胞免疫荧光、流式细胞术鉴定。用丝裂霉素处理过的 PD-L1 高表达细胞与小鼠脾淋巴细胞共培养，流式细胞术检测 PD-L1 对淋巴细胞 增 殖 作 用 的 影 响 。（ 3 ） 动 物 实 验 分 组 ： 实 验 组 （ 混 合 接 种 了 B16 细 胞 和 L929-pcDNA3.1(+)-PDL1 细胞的小鼠）、对照组 1（单独接种 B16 细胞）、对照组 2（混合接种 B16 细胞和 L929-pcDNA3.1(+)细胞）、对照组 3（混合接种灭活 B16 细 胞和 L929-pcDNA3.1(+)-PDL1 细胞）。按实验分组将细胞混合腋下接种昆明小鼠， 在动物水平观察间质细胞中 PD-L1 表达水平的改变对肿瘤生长及转移的影响并测 定免疫学指标。结果 （1）分别以 2μg/ml、1μg/ml、 0.5μg/ml DDP 刺激 L929 细胞之后，L929 细胞上的 PD-L1 的表达水平增高。但以更低剂量的 DDP 刺激 L929 细胞之后无 PD-L1 表达水平的改变。（2）PCR 方法获得小鼠 PD-L1 全长基因，通过 EcoRI/XhoI 双酶切及测序证实构建的重组质粒 pcDNA3.1(+)-PD-L1 正确；转染细胞经 G418 筛 选后获得稳定表达 mPD-L1 的 L929 细胞株：RT-PCR 显示转染 pcDNA3.1(+)-PDL1 质粒的 L929 细胞出现约 900bp 条带（mPD-L1 mRNA 的表达），对照组无目的条带 出现；荧光显微镜下观察转染 pcDNA3.1(+)-PDL1 质粒的 L929 细胞可见红色荧光， 表明有 PD-L1 蛋白的表达，阴性对照细胞（转染 pcDNA3.1(+)质粒的 L929 细胞） 未见红色荧光；流式细胞术鉴定转染空载 pcDNA 3.1(+)的 L929 细胞相比，转染 pcDNA3.1(+)-PD-L1 的细胞的荧光值明显增高，确定重组质粒在 L929 细胞中高效 表达。（3）PD-L1 抑制小鼠脾淋巴细胞的增殖。（4）小鼠的肿瘤生长率实验组较对照组快；实验组小鼠血清使鸡血红细胞溶血率显著降低，间接反映小鼠机体免疫能力较对照组小鼠降低了；实验组小鼠脾脏 NK 细胞对 B16 细胞的杀伤活性较对照组 降低；实验组小鼠淋巴细胞增殖能力较对照组减弱。结论（1）低剂量 DDP 刺激 L929 细胞可以上调其 PD-L1 表达量；（2）成功构 建真核表达质粒 pcDNA3.1(+)-PD-L1；（3）建立稳定表达 m