raav2trail的构建及对恶性黑色素瘤细胞的凋亡作用-construction of raa v2 trail and its apoptosis effect on malignant melanoma cells.docxVIP

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2018-06-01 发布于上海
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raav2trail的构建及对恶性黑色素瘤细胞的凋亡作用-construction of raa v2 trail and its apoptosis effect on malignant melanoma cells.docx

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raav2trail的构建及对恶性黑色素瘤细胞的凋亡作用-construction of raa v2 trail and its apoptosis effect on malignant melanoma cells

摘要摘要目的探讨腺相关病毒(adeno-associatedvirus,AAV)介导的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumornecrosisfactor-relatedapoptosisinducingligand，TRAIL)基因对恶性黑色素瘤细胞的凋亡作用。方法采用PCR方法，以TRAIL质粒为模板，扩增出编码sTRAIL的TRAIL胞外区片段，将此TRAIL胞外区片段插入真核表达载体，构建出穿梭质粒pSNAV2.0-sTRAIL，利用细胞内质粒DNA同源重组法将扩增出的sTRAIL片段插入至腺相关病毒载体上，构建出携带有表达sTRAIL的重组腺相关病毒rAAV2-sTRAIL。将该病毒体外转染人恶性黑色素瘤细胞A375（实验组）及人胚肾细胞HEK293（对照组），ELISA、Westernblot法检测目的基因在细胞中的表达，MTT法检测其对细胞增殖的影响，电镜下观察及流式细胞仪检测rAAV2-sTRAIL对A375的凋亡作用，分析其体外抗人恶性黑色素瘤细胞的机制。结果成功构建出病毒rAAV2-sTRAIL，PCR检测目的基因条带正确；Westernblot方法可在细胞内检测出现明显TRAIL条带；转染48小时后ELISA法检测细胞培养液中TRAIL，HEK293培养基中浓度为190.6±24.1ng/ml，A375培养基中浓度为56.7±12.4ng/ml；MTT法见rAAV2-sTRAIL可对A375增殖有明显影响，而对HEK293无明显影响；电镜观察及流式细胞仪检测证实rAAV2-sTRAIL可诱导恶性黑色素瘤细胞A375凋亡。结论AAV2-sTRAIL可以在人正常细胞HEK293及恶性黑色素瘤细胞A375中高效表达并分泌到胞外，对恶性黑色素瘤细胞A375有明显的诱导凋亡作用，而对HEK293无明显影响。【关键词】腺相关病毒肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体人恶性黑色素瘤细胞人胚肾细胞凋亡IIABSTRACTObjectiveToinvestigatetheadeno-associatedvirus(adeno-associatedvirus,AAV)-mediatedapoptosisoftumornecrosisfactor-relatedapoptosisinducingligand(Tumornecrosisfactor-relatedapoptosisinducingligand,TRAIL)geneformalignantmelanomacells.MethodsPCRmethodwasemployedtoamplifytheextracellularregionofTRAILfragmentencodingsTRAIL,withTRAILplasmidasatemplate,thisinsertedintotheeukaryoticexpressionvectorwasconstructedshuttleplasmidpSNAV2.0-sTRAIL,theuseofplasmidDNAincellshomologousrecombinationmethodsTRAILfragmentinsertedintotheadeno-associatedvirusvectorcarryingsTRAILconstructedrecombinantadeno-associatedvirusrAAV2-sTRAIL.ThevirusinvitrotransfectionofhumanmalignantmelanomacellsA375(experimentalgroup)andhumanembryonickidneycellsHEK293(controlgroup),ELISA,Westernblotanalysiswasemployedtodetecttheexpressionofthetargetgeneincells,MTTassayitseffectoncellproliferation,electronmicroscopyandflowcytometrywasemployedtoanalyzethemechanismofinvitroagainsthumanmalignantmelanomacellonapoptosisA375.ResultsSuccessfullyconstructedavirusrAAV2-sTRAIL,thetargetgenebandscanbesignificantdetectedbyPCR;TRAILbandscanbedetectedsignificantintracellularbyWesternblotmethod;48hoursaftertransfectioncells