ras蛋白在兔蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛模型中作用-role of ras protein in cerebral vasospasm model aft subarachnoid hemorrhage in rabbits.docxVIP

前言脑血管痉挛（cerebral vasospasm，CVS）是指动脉瘤破裂后蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）后颅内血管平滑肌收缩或血管壁损伤后引起的管 腔形态学上改变[1]。蛛网膜下腔出血后暴露于凝血块的脑血管发生迟发性收缩而引起 脑血管痉挛，一般发生在出血后3-14天，3-7天时为高峰期，严重的脑血管痉挛常常伴 有继发性脑缺血[2]，继而出现迟发性缺血性障碍（delayed ischemic deficits，DID）。 脑血管痉挛是蛛网膜下腔出血后最严重的并发症之一，发病率高达30-90％，通过动脉 造影检查发现65%-70％的蛛网膜下腔出血患者存在明显的血管狭窄。国内外的一些学 者长期以来对脑血管痉挛进行了大量基础和临床的研究，但其病理生理机制尚未完全 阐明，故至今仍无一套理想预防和治疗手段来应对脑血管痉挛的发生。因此，对其发 病机制进行深入研究具有重要意义。信号转导（signal transduction）是20世纪90年代以来生命科学研究领域的热点问 题和前沿。细胞信号转导是指细胞通过胞膜或胞内受体感受信息分子的刺激，经细胞 内信号转导系统的转换，从而影响细胞生物学功能的过程，如离子通道的开放或关 闭，离子浓度的改变，酶活性的改变和物质代谢的变化。基因表达的改变和对细 胞存活、凋亡、分化和增值的影响，参与了多种细胞生物学作用[3]。许多研究表明 [4]，许多疾病的发生原因和发展过程都与某个信号转导或信号转导中的某环节出错有 关。近年来，许多学者对蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛形成中所涉及的信号转导途径 引起了重视，在研究中发现的部分信号分子被用作临床治疗脑血管痉挛的新思路[5]。 蛛网膜下腔出血发生后所产生的血管活性物质、炎症反应及渗出到血管外的血液都能 刺激机体产生分子信号并激活信号通路，而Ras/MAPK信号通路是此重要的转导途径 之一。整个Ras/MAPK（mitogen activated protein kinase，丝裂原活化蛋白激酶）信号通 路参与了胚胎的发育，对细胞的分化、增殖、死亡等生物学过程起着重要的调控角色， MAPK家族是这一信号通路的主要成员。在哺乳动物细胞中，Ras/MAPK途径级联反 应由酪氨酸激酶（RTK）受体家族活化引发[6]。RTK与相应配体结合后RTKs形成二聚体，激活Ras与GTP的结合，使Raf招募到细胞膜并与之结合，随后MEK、ERK、MAPK等信号分子也依次被磷酸化而活化， MAPK活化相应的转录因子，如蛋白激酶 等，引起多重的生物学效应发生。GTP-Ras还可以通过另一途径MEKK来激活MEK。研究认为脑血管痉挛的发生可能与以下因素有关[7-9]：氧合血红蛋白（oxyhemoglobin，OxyHb）、一氧化氮（NO）以及内皮素-1（ET-1）等在内的多种 血管活性物质均与脑血管痉挛的发生有关。在这些血管活性物质中，由于OxyHb的出 现时间和脑血管痉挛的发生时间基本一致，因此是目前最为肯定的致痉物质。同时， 脑血管痉挛发生时动脉壁内可出现大量的炎细胞浸润，并且能够在血管壁、脑脊液以 及血液中检测到大量的免疫复合物和炎性介质，给与抗炎治疗后能够部分缓解脑血管 痉挛的程度，因此，免疫炎症反应也被认为是引起蛛网膜下腔出血后发生脑血管痉挛 的因素之一。近年研究发现，颅内动脉瘤破裂后蛛网膜下腔出血所溢出的血管活性分 子能激活MAPK信号通路。Ras蛋白是MAPK级联的上游激酶，因此，有理由推测蛛网 膜下腔出血后脑血管痉挛形成的病理过程中Ras信号分子也可能被激活并参与，那么 缓解血管痉挛程度可以通过抑制Ras活性而实现。本实验的兔蛛网膜下腔出血模型是采用枕大池二次注血法建立的[10]，通过研究 GTP-Ras的表达与痉挛的脑血管形态学和功能改变之间的关系，以及炎症反应和细胞 凋亡病理发生过程的关系，分析Ras蛋白的激活在脑血管痉挛形成过程中的作用和病 理机制，为蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的临床治疗提供新的思路和治疗靶点。实验材料与实验方法1 实验材料：1.1.主要实验试剂：水合氯醛上海兔抗磷酸化ERK1/2多克隆抗体美国SantaCruz公司鼠抗兔IgG美国SantaCruz公司TUNEL试剂盒武汉羊抗鼠IgG美国SantaCruz公司DMSO美国Sigma公司FTI-277美国Biosource公司1.2.主要实验仪器和设备：低温离心机美国Beckman公司酶标仪上海恒温振荡器北京-80℃低温冰箱美国Thermo公司紫外/可见光分光光度计美国Thermo公司超净工作台北京电子分析天平上海倒置显微镜日本尼康光学显微镜日本尼康荧光显微镜日本尼康1.3.实验动物的选取及实验分组 实验共选用健康清洁级新西兰白兔50只，性别任意，体重约在2.5kg