realtime rtpcr检测jev方法的建立与jev入侵bhk21细胞内吞途径的初步研究-establishment of a real time rt pcr assay for jev detection and preliminary study on the endocytosis pathway of jev invading bhk 21 cells.docxVIP

论文独创性声明iiU啊!酬t? t tIOU-，三27本人郑重声明:所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包 含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学 或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所 做的任何贯献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生乡级必 )-0 to年 6 月，g日关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即:学校有权保留井向 国家有关部门成机构送交论文的复印付和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不问媒体 上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生步解签名:带飞主 (::年 t，gsVo lo 年6 月 18 日中文摘要流行性乙型脑炎是由日本乙型脑炎病毒 (Japanese encephαlitis virus ，JEV) 引起的严重危害人商健康的一种虫媒传染病。病毒进入宿主细胞是感染早期的关 键环节，病毒和细胞的不间，病毒进入细胞的方式和途径也不同。本研究建立了 Real-time R下PCR 检测日本乙搜脑炎病毒的方法，并应用该方法对日本乙型脑炎 病毒入侵细胞的内吞途径进行了初步研究。1.Re划-time RT-PCR 检测 JEV 方法的建立本文根据 GenBank:登录的 JEV (SAI4幽 14-2) 序列，设计合成了一对特异性引 物，构建了 JEV 质粒标准品，建立了实时荧光定量聚合酶链式反应 (Real幡time RT-PCR) 检测 JEV 的诊断方法。通过检测 10 倍系列稀料的 JEV 标准质粒模板显示，该方法的灵敏度能达到 15 ∞pieso 对不同浓度的质粒标准品进行组内和组间意复性实验，其变异系数 (CV)均小于 5%，显示该方法具有良好的重复性: 对乙型脑炎病毒 (JEV)、猪瘟病毒 (CSFV) 、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV) 等病毒进行扩增，结果显示该方法对 JEV 具有高度特异性。该方法建立的标准 曲线为: Y=-0.3007X + 10.53，拟合度-?据0.997 ，PCR 循环效率为 96.53 %;研究 结果表明，该方法快速、灵敏度高、特异性强、重复性好且能实时定量检测，可 用于 JEV 分离鉴定、 JEV 感染疑似病例检测、 JEV 感染定量检测研究及其分子 流行病学调查。2. 日本乙型脑炎病毒入侵 BHK-21 细胞的内吞途径初步研究 本试验选用氯两嗦、制霉素和细胞松弛素 D 三种药物分别处理细胞，以阻滞网格蛋白介导内吞途径、细胞膜穴样内陷途径和巨胞饮途径，然后进行 JEV 感 染实脸，通过 Real翩tíIne RT-PCR 方法测定感染后 1 b ，12 b，24 h 细胞内的病毒 拷贝数，结果显示:与仅实施感染实验、未进行药物处理的对照组比较，三个药 物处理组的细胞内病毒拷贝数，在感染后各时相点均呈现不同程度的下降，其中 氯丙嗦处理组下降最为明显，感染后 1 h 、12 b、24 b 细胞内病毒拷贝数分别下 降了 59.58 %， 53.34 %， 61.35 %;而细胞松弛素口和制霉素处理组仅有少量下 降。在感染后 1 b.. 12 h 和 24b，细胞松弛素。组细胞内病毒拷贝数分别下降了 23.59 %， 30.77 %， 30.14 %;制霉素组细胞内病毒拷贝数分别比对照组下降了35.56 %， 34.40 %， 34.40 %。试验结果表明: JEV 主要利用网格蛋白介导内吞途径进入 BHK-21 细胞。关键词:日本乙型脑炎病毒:实时荧光定量 R下PCR; 内吞途径ABSTRACTJapanese Epidemic Encephalitis is a serious mosquito-bome disease caused by the Japαnese encephalitis virus (JEV)，which threatens the health of humans and livestock. Virus en位y into the host cel1s is a critical st叩at the early phase of infection. Tbe pathway of virus en町 into host cells are differs from cell ωcell. In伽estud弘 a real-time R下PCR assay was developed for efficient