rna干扰介导泛素连接酶murf1和叉头蛋白转录因子foxo3a基因下调延缓失神经骨骼肌萎缩的体外分析-rna interference mediated down-regulation of ubiquitin ligase murf1 and fork protein transcription factor foxo 3a gene to delay denervated skeletal muscle atrophy in vitr.docxVIP

RNA干扰介导泛素连接酶MuRF1和叉头蛋白转录因子FOXO3a基因下调延缓失神经骨骼肌萎缩的体外研究摘要目的探讨RNAi技术体外抑制MuRF1或FOXO3a基因表达的效果，为RNAi介导的失神经骨骼肌萎缩基因治疗奠定基础。方法订购MuRF-1和FOXO3a两基因的siRNA重组质粒，培养大鼠成肌细胞系L6，将MuRF1和（或）FOXO3asiRNA重组质粒在Lipofectamine2000介导下转染，荧光倒置显微镜下观察细胞生长状态，于转染后48h与72h，采用实时定量PCR和Westernblot检测siRNA重组质粒对MuRF1和FOXO3a的mRNA和蛋白质水平的抑制效果。结果1.转染后24h，荧光倒置显微镜下观察到细胞中有绿色荧光表达，表明成功将质粒转染到大鼠成肌细胞系L6中。2.实时定量PCR分析结果显示：MuRF1与FOXO3a各自的siRNA重组质粒转染后48h，二者干扰序列在mRNA水平分别明显抑制了MuRF1和FOXO3a的表达，抑制率达67％和54％，与对照组相比差异有统计学意义（P0.05）,联合MuRF1与FOXO3a两基因siRNA重组质粒转染后48h，干扰序列在mRNA水平亦明显抑制了MuRF1及FOXO3a的表达，抑制率达61％及58％，与对照组相比差异有统计学意义（P0.05）；转染后72h，MuRF1与FOXO3a各自的siRNA重组质粒干扰序列对MuRF1和FOXO3a的mRNA的抑制率分别达79％和81％，联合MuRF1与FOXO3a两基因siRNA重组质粒干扰序列对MuRF1和FOXO3a的mRNA的抑制率达77％及72％，与对照组相比差异有统计学意义（P0.05），抑制效应与48h相比更为明显。但单独转染组与联合转染组之间抑制效应差别无统计学意义（P0.05）。3.Western印迹灰度分析结果显示：转染后48h，干扰序列MuRF1明显抑制了IMuRF1蛋白的表达，抑制率达61％，干扰序列FOXO3a明显抑制了FOXO3a蛋白的表达，抑制率达46％，二者与对照组相比差异均有统计学意义（P0.05）,联合MuRF1与FOXO3a两基因siRNA重组质粒干扰序列对MuRF1和FOXO3a蛋白表达的抑制率达64％及42％，与对照组相比差异亦有统计学意义（P0.05）；转染后72h，干扰序列MuRF1对MuRF1蛋白表达的抑制率达70％，干扰序列FOXO3a对FOXO3a蛋白表达的抑制率达72％，同样二者与对照组相比差异均有统计学意义（P0.05）,联合MuRF1与FOXO3a两基因siRNA重组质粒干扰序列对MuRF1和FOXO3a蛋白表达的抑制率达73％及74％，与对照组相比差异有统计学意义（P0.05）,抑制效应较转染后48h更为明显。但单独转染组与联合转染组之间抑制效应差别无统计学意义（P0.05）。这与干扰序列对mRNA表达水平的影响一致。结论1.RNA干扰技术在体外能够明显抑制泛素连接酶MuRF1和叉头蛋白转录因子FOXO3a基因的表达。.体外研究中MuRF1与FOXO3a两基因siRNA重组质粒联合转染与各基因siRNA重组质粒单独转染其干扰序列对MuRF1或FOXO3a的mRNA和蛋白抑制效果无差别。.活体实验中MuRF1与FOXO3a两基因siRNA重组质粒联合转染与各基因siRNA重组质粒单独转染其干扰序列对MuRF1或FOXO3a的mRNA和蛋白抑制效果尚不明确，这为RNAi介导的失神经骨骼肌萎缩基因治疗提供了一种新的思路。关键词：肌萎缩；MuRF1；FOXO3a；L6；失神经；RNA干扰；基因表达RNAi-mediatedGeneDownregulationofUbiquitinLigaseMuRF1andForkheadActivinAignalTransducerFOXO3aCanAmeliorateRatDenervatedSkeletalMusleAtrophyAbstractObjectiveToinvestigatetheeffectofRNAitechnologyinhibitinggeneimpressionofMuRF1orFOXO3ainvitro,establishingafoundationforRNAimediateagenetherapyofdenervatedskeletalmuscleatrophy.MethodsBuytheplasmidMuRF1andFOXO3a-siRNA,6holecellcultureplatetrainingratsintomusclecelllinesL6,transfect2μgMuRF1orFOXO3asiRNAgenerecombinantplasmidintoL6,underfluorescen