rnf111通过调控tgfβsmad信号通路影响非小细胞肺癌转移的表观机制-rnf 111 influences the apparent mechanism of non-small cell lung cancer metastasis by regulating tgf β smad signaling pathway.docxVIP

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2018-06-01 发布于上海
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rnf111通过调控tgfβsmad信号通路影响非小细胞肺癌转移的表观机制-rnf 111 influences the apparent mechanism of non-small cell lung cancer metastasis by regulating tgf β smad signaling pathway.docx

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rnf111通过调控tgfβsmad信号通路影响非小细胞肺癌转移的表观机制-rnf 111 influences the apparent mechanism of non-small cell lung cancer metastasis by regulating tgf β smad signaling pathway

中文摘要背景与目的：由于发病率和死亡率增长最快，肺癌成为对人群身体健康威胁最大的恶性肿瘤之一。而且因为早期诊断技术和后期的有效治疗的缺乏，约占肺癌 85%的非小细胞肺癌有着高达 86%的死亡率，因此，探索和研究清楚非小细胞肺癌的致病机理则显得尤为重要。DNA 的甲基化作为表观遗传学研究的重要内容之一，被认为是最典型导致基因表达或者沉默的机制，大量的研究也表明它与肿瘤的发生发展密切相关。TGF-β信号通路的异常与多种肿瘤的发生和转移有着紧密的联系。RNF111 基因编码的蛋白 Arkadia 可以通过泛素化途径促进 TGF-β信号通路中的负调控因子 Smad7, SnoN 和 Ski 的降解来增强 TGF-β信号通路。本研究主要通过检测 RNF111 基因在两株非小细胞肺癌 95C（低转移）和 95D（高转移）中 mRNA 表达水平，来探索两株细胞株中 RNF111 的 mRNA 表达水平的差异与基因启动子区甲基化引起的基因转录调控改变之间潜在的机制。方法：Transwell 实验检测 95C、95D 和 A549 细胞的迁移和侵袭能力；运用 Real-Time PCR 和 western blot 检测 2 株细胞株（95C 和 95D）中 RNF111 基因的表达, 并且取 6 对模拟 95C 和 95D 细胞的 NSCLC 患者癌组织样本，检测组织中 RNF111 的 mRNA 水平；同时利用 BSP 克隆测序的方法分析 95C、95D 细胞株和组织中的 CpG 位点的甲基化频率，分析这些 CpG 位点甲基化频率的差异是否与其基因表达水平的差异相关；用 Western Blot 检测 TRANSFAC 软件预测的转录因子 SP1 在 95C 和 95D 细胞中的表达情况；利用 EMSA (electrophoretic mobility shift assay) 实验技术，验证 RNF111 启动子的-459CpG 位点的甲基化是否影响转录因子对启动子的的结合。用 ChIP（Chromatin Immunoprecipitation）方法分析 SP1 能否与-459CpG 位点结合；构建荧光素酶报告基因质粒和双荧光实验来检测 SP1 的结合与否对 RNF111 启动子活性的影响，并且验证-459CpG 位点甲基化是否能够降低 RNF111 的启动子活性，同时运用 western blot 方法检测 RNAi 干扰 SP1 之后 RNF111 的表达；RNAi 方法干扰 RNF111 后运用 western blot 方法检测 TGF-β通路标记分子 p-SMAD3 和 E-cadherin 等在 95C 和 95D 中表达。结果：用去甲基化药物 5-Aza 处理 95C 和 95D 细胞后，RNF111 基因表达水平明显升高，暗示着 DNA 的甲基化影响了 RNF111 基因的表达；通过 TRANSFAC 软件预测和 CHIP 实验的验证，RNF111 基因启动子区的-459CpG 位点是一个功能性位点，转录激活子 SP1 能够与-459CpG 位点结合;SP1 结合位点缺失和突变/link?url=uZw7j5h61kiZnlYcJ-AuqaIhqs1_V-rZmoLD_f4JpKBiyopf10oK6GSXVlGJMRJ1zKEcWa8uI17R1OoBgo42K_的荧 /link?url=uZw7j5h61kiZnlYcJ-AuqaIhqs1_V-rZmoLD_f4JpKBiyopf10oK6GSXVlGJMRJ1zKEcWa8uI17R1OoBgo42K_光素酶检测实验说明 SP1 能够增强 RNF111 启动子活性；而且通过 EMSA 和/link?url=uZw7j5h61kiZnlYcJ-AuqaIhqs1_V-rZmoLD_f4JpKBiyopf10oK6GSXVlGJMRJ1zKEcWa8uI17R1OoBgo42K_荧光 /link?url=uZw7j5h61kiZnlYcJ-AuqaIhqs1_V-rZmoLD_f4JpKBiyopf10oK6GSXVlGJMRJ1zKEcWa8uI17R1OoBgo42K_素酶检测实验证明了-459CpG 位点的甲基化能够降低转录因子与 RNF111 基因启动子区的结合能力及 RNF111 的启动子活性；在转移的 NSCLC 细胞中，干扰 RNF11 1 的相关实验暗示 RNF111 增强了 TGF-β/Smad 信号通路的活性和非小细胞肺癌细胞株的转移和侵袭能力。结论：研究显示在非小细胞肺癌细胞株中，RNF111 基因近端启动子区-459CpG 位点的甲基化降低了 RNF111 基因的表达，可能的机制是-459CpG 的甲基