人抗氧化基因txn1和glrx2克隆、测序与表达.pdfVIP

摘 要 摘 要 环境污染，尤其是紫外线照射、化学物质、电离辐射、压力、吸烟、酒精、 农药、食物添加剂等外来因素均能促使人体内产生大量的自由基。自由基在身体 的各个地方每天以1011 的数量不断形成，一旦不能很快地被捕获，就会引起机体 功能紊乱。自由基能攻击和氧化控制细胞生长和发育的遗传物质DNA，由此增加 患癌症的可能性、促进多种疾病的不良发展和导致过早衰老。 前 期 自 由 基 氧 化 损 伤 的 研 究 发 现 ， 生 物 体 内 的 氧 化 还 原 系 统 （Reduction-oxidation system, redox system）存在着氢受体与氢供体，其中 典型的氧化还原系统有：硫氧还蛋白/硫氧还蛋白还原酶（Trx/Trx reductase）、 脱嘌呤/脱嘌呤内切核酸酶（Apurinic/apyrimidinic endonuclease）、铁氧还蛋 白/铁氧还蛋白还原酶（Ferredoxin/ferrdoxin reductase）、谷氧还蛋白 （Glutarrdoxin, Grx）、催化生物体内二硫化物构象的蛋白质（DsbA）等，它们 对生物体内氧化还原状态有着重要的调节作用。 而目前已知的细胞内复杂二硫化物还原的系统主要有硫氧还蛋白系统 （Thioredoxin system）和谷氧还蛋白系统（Glutaredoxin system）。前者包括 NADPH、硫氧还蛋白（Thioredoxin, Trx）和硫氧还蛋白还原酶（Thioredoxin reductase, TR）,后者包括还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）、谷胱甘 肽（Glutathione, GSH）、谷胱甘肽还原酶（Glutathione reductase, GR）和谷 氧还蛋白（Glutaredoxin, Grx）。 笔者选取了同时存在于细胞核内的 Trx1 和 Grx2 作为整体进行研究，通过 GENE BANK 查找 TXN1 和 GLRX2 基因序列，设计引物，在人HeLa 细胞cDNA文库 中通过PCR技术对其进行扩增，初步鉴定后构建重组质粒，然后对质粒DNA进行 测序鉴定，最后构建真核表达载体并在哺乳动物 CHO 细胞中表达基因 TXN1 和 GLRX2，得到表达蛋白Trx1和Grx2，并对蛋白进行了鉴定。 主要取得如下成果： 1、成功从HeLa细胞中扩增出目的基因 TXN1 和 GLRX2。 2 、成功构建重组质粒pCMV–Tag3-TXN1 和pCMV–Tag3- GLRX2。 3、对 TXN1 和 GLRX2 进行序列测定，序列结果正确。 I 人抗氧化基因 TXN1 和 GLRX2 的克隆、测序与表达 4 、成功构建真核表达载体并在哺乳动物CHO细胞中高效表达了基因TXN1和 GLRX2，得到表达蛋白Trx1和Grx2。 与其它系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确 折叠，提供复杂的 N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而 表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白 质分子。 蛋白在活体内的功能涉及多层次多元化的调控过程，整个机体是一个精细的 调控系统。因此构建真核表达载体，获得由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生 的外源蛋白质对于后续的研究工作具有非常重要的现实意义，不仅为氧化损伤、 抗氧化研究奠定了基础，而且为抗氧化蛋白Trx和Grx抗氧化协调机制的研究提 供了依据，更是抗氧化蛋白Trx和Grx由实验走向生产应用探索的开始。 关键词：硫氧还蛋白；谷氧还蛋白；克隆；测序；真核表达 II 摘 要 ABSTRACT Environmental pollution, particularly ultra