分子信标技术在生物酶和ATP等重要生物分子检测中应用.pdf

摘要 生物酶和ATP等重要生物分子是生物体和生命现象的结构基础和功能基础，在物质 代谢、机体防御、血液凝固、肌肉收缩、细胞信息传递、个体生长发育、组织修复等方 面发挥着不可替代的重要作用，它们的含量和活性直接关系到生物体的健康。因此，深 入研究这些生物分子之间的相互作用，特别是建立这些生物分子快速、简便、准确、灵 敏的分析方法，对分子水平上阐明生命的奥秘、新型药物的开发，攻克许多疑难病症以 及促进信息科学的发展都有重要的意义，是当前生物分析化学研究的前沿和热点。 本论文以上述科学问题为目标，结合当前发展的核酸探针技术和分子生物学手段， 巧妙地利用了核酸酶(连接酶或聚合酶)、核酸以及分子信标核酸探针的特殊性质，发 展了激酶、磷酸酶和限制性内切酶等生物酶活性实时检测的新方法。更重要的是，首次 将分子信标探针用于三磷酸腺苷(ATe)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、烟酰胺腺嘌呤 二核苷酸磷酸(NADP)等重要生物小分子的检测。主要内容归纳如下： 蛋白激酶等重要生物分子的检测。具体包括以下六个部分： 1、分子信标技术结合T4DNA连接酶用于ATP的检测。利用I4DNA连接酶对ATP DNA连 的高度依赖性，我们发展了一种ATP检测新方法。在ATP存在的条件下，T4 接酶以分子信标为模板，将两段短核酸片段连接，连接产物将分子信标打开，荧光信号 增强，从而达到检测ATF的目的。该方法灵敏，简单，其线性响应范围为1-300 riM,检 测下限为O．14nM。并利用该方法对细胞内的ATP水平进行了初步分析． 一2、分子信标技术用于肌酸激酶活性的检测。二磷酸腺苷(ADP)与磷酸肌酸在肌酸激 酶催化作用下生成肌酸和ATP，由于T4DNA连接酶对ATe的高度依赖性，I4DNA 连接酶就会识别并利用生成的ATP进行DNA连接反应，产生的长链DNA将分子信标 u几， 打开，使荧光信号增强，达到检测肌酸激酶活性的目的。其线性响应范围为1～50 检测下限为O．64 U／L。并用此方法考察了药物对CK活性的影响。该方法快速、简便、 灵敏度高。 3、分子信标技术用于蛋白激酶A活性的检测。以蛋白激酶A为模型，通过测定蛋 白激酶催化后所剩余的ATP的量来检测蛋白激酶的活性。T4DNA连接酶和分子信标底 物被用于ATP的检测，其线性响应范围为12。5-150nM，检测下限为1．25nM。并考察 了药物染料木素对蛋白激酶A的抑制作用。该方法不用进行同位素标记、操作简便，具 有通用性。 4、分子信标结合酶信号放大检测ATP。结合连接酶、腺苷酸激酶和核苷二磷酸激 Ⅱ 分子信标技术在生物酶和ATP等重要生物分子检测中韵应用 ml dCTP在核苷二磷酸激酶催化下生成ATP，使得ATP得到循环。利用34DNA连接酶对 ATP的高度依赖性，ATP的不断产生使得被打开的分子信标不断增加，检测的线性范围 为0．01-10 nM，检测下限为5 pM，与最灵敏的ATP检测方法生物发光法的灵敏度相当。 5、基于分子信标的NAD高灵敏检测方法。本章利用大肠杆菌DNA连接酶对NAD 的商度依赖性，发展了一种NAD检测新方法。在NAD存在的条件下，大肠杆菌DNA 连接酶被激活，并以分子信标为模板，将两段短核酸片段连接，连接产物将分子信标打 开，荧光信号增强，从而达到检测NAD的目的。该方法灵敏，简单，其线性范围为0．3,-40 nM及40--300nM，检测下限为0．3nM。并利用该方法考察了卡路里限制对MCF7细胞 内NAD水平的影响。 6、基于分子信标的NADP高灵敏检测方法。首先利用碱性磷酸酶将NADP的磷酸 根切除转化生成NAD，然后将NAD加入到分子信标及大肠杆菌DNA连接酶连接体系 中进行检测，通过记录并计算荧光增强的初速度来定量，检测的线性范围为5～200nM， 检测下限为2nM。这是一种简单、快速、高灵敏度的NADP分析新方法，且具有良好