猪圆环病毒2型orf2基因重组质粒制备及其对小鼠免疫效应.pdfVIP

猪圆环病毒2型 ORFZ基因重组质粒的制备 及其对小鼠的免疫效应 摘 要 质粒的制备是分子生物学是最基本的操作之一。随着DNA疫苗和基因重组药物研 究和应用的快速发展，质粒的需求量不断地增加，常规的质粒制备方法已经不能满足当 前的需要。在DNA疫苗方面，由于给动物的免疫剂量不足，其效果不明显，与传统的 疫苗相比，优势体现不出来，限制了其应用。本文描述了一种获取质粒的新方法，在碱 裂解方法的基础上应用过滤的方法除去蛋白质和大的基因组DNA，首先用干酪包布过 滤裂解液，异丙醇沉淀，然后再用孔径为0.22林m混合纤维素酷微孔滤膜过滤滤液，并 ‘ 用07%的乙醇溶液进行冲洗滤膜，自然风千，然后用双蒸水把质粒DNA从滤膜上洗脱 下来.该方法不仅适用于质粒DNA的小量抽提，而且适用于soomL菌液的抽提，产 量为51m/gL，得到质粒DNA的。D62/0280平均为1.89。并且该方法操作简单，操作 过程中未用有毒有害的物质，而且产量高，纯度好，不仅可用于酶切、连接和转化等分 子生物学实验，还可以满足核酸疫苗生产的需要。 猪圆环病毒2型印。rcinecircoviursPyteZ，PCv)2是引起猪断奶后多系统衰竭综合征 及其它相关疾病的病原。本研究将表达猪圆环病毒2型ORFZ基因的一套真核表达元件 系统克隆插入到质粒载体pMD一81T，构建成pMD种T-ORfZ，转化入E.ocliDHa5，用本 试验室建立的方法提取质粒，经肌肉注射途径对Balblc小鼠分别在第ld、第41d和第 82d进行免疫，用生理盐水作对照，每周采血，对其抗体变化进行监测，在第65d采 取小鼠的脾淋巴细胞，用淋巴细胞转化试验，NK细胞杀伤活性试验，和对脾淋巴细胞 中各细胞亚群的变化来观察分析pMD一ORFZ对Bbalcl小鼠的细胞免疫的效果。结果 表明，小鼠血清中特异性抗体水平略有上升，在第41d达到峰值，但是虽然经两次加 强免疫抗体水平并没有显著变化，从第65d特异性抗体水平开始出现下降趋势;脾淋 巴细胞体外增值能力实验组比对照组低，而且差异显著伊0.O)1;免疫pMI)T-ORFZ 的小鼠脾脏 NK细胞杀伤活性明显比生理盐水对照组高，自然杀伤率分别为 65一01叹迁481%和923.s/odel.42%(p0.01);通过流式细胞术对小鼠脾淋巴细胞分析，发 现试验组小鼠脾脏中Th 细胞的百分含量与生理盐水组小鼠相比无显著差异，但是Tc 细胞的百分含量比生理盐水组的高许多伊0.0)5.关于B细胞，试验组比对照组有所 减小，但是差异不显著田0.05). 关键词:质粒制备，PCvZ，DNA疫苗，小鼠，免疫效应 PREPAR户TLIONANDIMMUNIZATION E叼MICEOF RECOMBINANTPLASMIDCARRYll叮GPCVZORFZGENE ABSTRACT PrPeraationofPlasmidisa允ndJa旧neta1mnalPulatinonimoleculrabioloygexPmne ellts. Withhte dveeloPmentofDNAvaccnei nadgenet沁recombinationmedicine，htequnatiytof Plasmidcna，tmeethtenedehteufllda口lentalrearch肚ldclinicalrtials.Forxean1Ple，hte DNA vaccnei cna、化acllnaidealcl五cinceyofrhte smallmmul n过nigodes’nad山eaPPlciatinosi lilllltde，hhtisreseaIcl1anewmehtodofPIasnjIdp卿肛atino isofundedsch即ylssihte b茜treiabyaklalme，tllenfiltrehte l邓atebyakindofclohtinordreoteradicatehteprotmes 助dthegnoemicDNA.Thefiltratewas PrecPiitatedbydimhetylcbranio1，htneitisfiltered bya砂 nigcelluloseestre而croproefilmofo.22料InniPoresize.又画nghte micropore flimusing70%alcohol，aferaird即