锌离子对重组大肠杆菌PAMC表达卤醇脱卤酶的调节作用研究.docx

三 峡 大 学 硕 士 学 位 论 文 分类号 Q81 密级 U D C 硕 士 学 位 论 文 锌离子对重组大肠杆菌 P84AMC1061 表 达卤醇脱卤酶的调节作用研究 学 位 申 请 人： 潘冬瑞 学 科 专 业： 生物化学与分子生物学 指 导 教 师： 李啸 副教授 二○一四年四月 1 万方数据 三 峡 大 学 硕 士 学 位 论 文 A Dissertation Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Science Research on regulatory role of Zn2+ on halohydrin dehalogenase expression and accumulation in recombinant Escherichia coli P84A/MC1061 Graduate Student: Pan dongrui Major: Biochemistry and Molecular Biology Supervisor: Prof. Li Xiao China Three Gorges University Yichang, 443002, P.R.China 2April, 2014 2 万方数据 万方数据 三 峡 大 学 硕 士 学 位 论 文 三峡大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成 果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作 品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明，本人完全意 识到本声明的法律后果由本人承担。 学位论文作者签名： 日 期： 三 峡 大 学 硕 士 学 位 论 文 内 容 摘 要 本文主要针对锌离子在基因工程大肠杆菌表达卤醇脱卤酶过程中的重要影响进行了系统研 究。首先，通过摇瓶实验显著筛选出影响卤醇脱卤酶表达的金属离子——Zn2+，并确定其最 优浓度为 0.7mg/L；其次，在 50L 罐中进行了上述摇瓶实验结果的放大研究，探索了分批发 酵过程中锌离子的最佳添加时机和浓度，对动态变化数据进行分析发现：锌离子不仅可显著 提高大肠杆菌的生理活性、比生长速率和营养物质消耗速率，还能有效提高卤醇脱卤酶的表 达以及酶的纯度， 在此基础上筛选出最优锌离子添加策略（ pdr4 ）， 发酵开始时加入 0.35mg/LZn2+，对数生长期快结束时（约 8h)加入 0.35mg/L，此策略下相比对照组，最大比 酶活和最大酶活分别提高 5.42%和 9.8%；第三，对 L-阿拉伯糖和 Zn2+的协同调节作用进行 了关联研究，研究发现：添加锌离子的情况下，L-Ar 添加含量为 1‰时最佳，卤醇脱卤酶可 以较好地积累和表达，而过量添加的 L-Ar 主要作为碳源参与菌体体内的磷酸戊糖途径。最 后，进行了 pH 梯度诱导及分批补料发酵卤醇脱卤酶，使得大肠杆菌菌体表现出很强的生理 活性，生长代谢非常旺盛，最大酶活比空白组提高了 12.3%，并且比酶活的大幅度提升，最 大比酶活达到 36160U/mg, 比空白组的最高比酶活整整提高了 6.1 倍，酶的纯度大大提高。 本研究为卤醇脱卤酶的调控机理研究奠定了一定的基础，并可为工业大规模发酵生产卤醇脱 卤酶提供了理论指导。 关键词：锌离子 卤醇脱卤酶 L-阿拉伯糖 比酶活 4 三 峡 大 学 硕 士 学 位 论 文 Abstract This systematic research focused on the effect and control of Zn2+ on halohydrin dehalogenase expression and accumulation in Escherichia coli P84A/MC1061, and attempted to explore the Zn2+ influence mechanism. Firstly, screened out the most significantly impact factor-Zn2+ from Zn2+, Fe2+, Co2+ which had obvious effects on HheC expression and accumulation by shake flask experiment, and determined the optimal concentration of Zn2+, 0.7mg / L; Then, did 50L fermentation scale-up studie