流式细胞术的基本原理与应用余琪琪.pptVIP

荧光补偿 采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成的误差 补偿公式 通常干扰光占该染料所发出荧光总量的X%。 RD1-X%FITC 补偿模型 PE-X%FITC 横平竖直 补偿调整的实验过程 样本准备：阴性样本，单阳性样本 调整：第一步：阴性样本调整所有PMT 第二步：单阳性样本调整补偿 自动调补偿 手动调补偿 判断标准：横平竖直 数据分析 数据显示方式：单参数直方图 二维散点图 二维等高线图 假三维图 三维图 列表模式 设门：在细胞分布图中指定某一个范围或某一细胞性状的细胞群，并对其进行单参数或多参数分析。 单参数直方图 双参数点图 二维等高图 Pseudo 3D Plot 3D Plot 密度图 假三维图 三维图 设门 设定阴性与阳性群体的界限 确定阳性与阴性细胞群体 统计阳性或阴性细胞群体的百分率，平均荧光值，绝对数或抗体结合数 流式细胞术的应用 细胞生理学研究（细胞相对大小和颗粒性、胞内pH值检测、Ca2+流动性检测、膜电势检测、细胞活性检测、细胞活力的检测） 细胞膜表面标记 胞内标记 细胞周期分析 凋亡分析 CBA （Cytometric Bead Array） 信号放大过程会产生不需要的脉冲信号，通常来自于碎片。通过设定某一信号的最低强度值，可将不需要的脉冲信号去除，这一设定值称为阈值。 * 流式细胞术的基本原理与应用简介 余琪琪 12-09-2011 流式细胞术 流式细胞术（Flow Cytometry）就是对处在快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术。 Injector Tip Fluorescence signals Focused laser beam Sheath fluid 流式细胞仪工作原理示意图 流式细胞仪可提供的信息 物理信息：通过散射光信号反映 荧光信息：通过荧光信号反映 散射光信号的产生 488nm激光产生散射光 SSC FSC 前向角散射光信号（FSC） 侧向角散射光信号（SSC） 利用散射光信号对混合细胞分群 红细胞裂解的全血 荧光信号的产生 荧光信号的表示方法 双参数点图 单参数直方图 一个完整的流式实验流程 样品的准备 荧光标记的选择 对照设置 仪器条件的确定 数据分析 样品准备 血液或骨髓标本 体液、灌洗液、悬浮培养细胞 贴壁细胞 组织标本 单细胞悬液，浓度5?105?1 ?106/mL 样本流速的选择 高流速：一般用于定性分析，如免疫分型。采集速度快，但分辨率低. 低流速：一般用于对分辨率要求较高的分析，如DNA分析。 （注：根据制备样本浓度随时调整流速） 荧光标记抗体的选择 尽量使用直标抗体 多色标记时应该增加各种抗体的用量或适当延长反应时间 根据流式细胞仪的类型及荧光素的光谱选择荧光抗体 根据检测物（抗原）表达量选择荧光染料 使用双标以上抗体需要做荧光补偿 流式细胞仪 型号：BD FACSCanto II 光学信号的产生： 激光（488nm，633nm） 光学信号的收集： 光学滤片 光电倍增管（PMT）：将光信号转换成电信号 FACSCantoII的光学滤片 长通滤片 （Longpass，LP） 带通滤片 （Bandpass，BP） LP500 500/50 750-810nm 650-670nm FACSCantoII信号检测组件 常见荧光染料的发射波长 荧光强度：APCPEPE-Cy7FITC 每个通道只能选择一种荧光素 各个通道之间的荧光素可以随意搭配 搭配的荧光素之间的发射光谱重叠尽量小 对照设置 阴性对照 阳性对照 补偿对照 阴性对照 空白对照：即不进行任何标记的细胞。主要用于确定待测标本的基础荧光域值 同型对照：即用同型抗体作平行实验。同型抗体为没有特异性、与荧光抗体蛋白亚型一致的免疫球蛋白，通常是未进行免疫小鼠血清的纯化IgG1或IgG2。 阳性对照 阳性对照：阳性对照即应用已知表达某种抗原的细胞（阳性细胞）进行平行实验。通常用于检测抗体是否有问题或确定实验方法的稳定性、准确性 补偿对照 补偿对照:多色荧光分析，进行荧光补偿