遗传学课件第9篇 章 基因操作-4h.pptVIP

Northern Blot 3、应用 （1）检测mRNA分子量大小（依电泳迁移率估计） （2）检测mRNA的含量，即基因表达水平高低（密度扫描仪，定量分析） 三、Western blot 蛋白水平检测，研究基因表达与功能的一种方法。 原理：抗原抗体特异性结合。抗原抗体反应 步骤： 组织或细胞 ↓ 提取蛋白 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白 ↓ 转移（印迹）于膜上 ↓ 加抗体检测某种特异性蛋白质 Western Blot 四、生物芯片技术 生物芯片，包括DNA芯片、抗原芯片、抗体芯片、细胞芯片、组织芯片等。是一种微型多参数生物传感器。在一微小固体载体表面固定大量的分子识别探针，构建一组微分析单元和系统，以实现对化合物、蛋白质、核酸、细胞或其他生物组分准确，快速、大量地筛选或检测。 基因芯片（又称DNA芯片，DNA微列阵），它集成了大量密集排列的基因探针，通过与被检测基因的碱基序列进行互补配对，实现核酸序列的分子识别。能同时分析大量基因，实现生物基因信息的大规模检测。 1、分离纯化目的基因 从基因组中分离目的基因； 由特定mRNA逆转录合成cDNA； 化学合成目的基因； PCR体外扩增目的片段。 2、构建重组DNA分子:目的基因 + 载体 重组的DNA分子导入特异宿主细胞的过程称转化。 重组DNA分子导入细菌后，随细菌繁殖不断复制和扩增，最终得到大量相同拷贝的目的DNA。 3、宿主细胞的转化 4、筛选含有重组DNA的细胞 将转化的细胞置于琼脂表面，刺激细胞克隆生长，由单个细胞增殖形成遗传相同的细胞群体——故称细胞克隆。 将阳性的克隆移至液体培养基中进行扩增。 5、分离重组DNA克隆： 收获扩增的培养细胞，并选择分离重组DNA。 细胞克隆选择增殖 四、目的基因表达 将目的基因与表达载体重组，导入宿主细胞表达出相应基因产物（蛋白）。 获得基因重组后产物——蛋白质。 如胰岛素、干扰素；生产疫苗的抗原等。此类克隆系统称表达克隆（expression cloning）。 目的基因表达 （一）真核细胞基因在原核细胞（细菌）中表达 真核多肽的表达要求： 1）适当的cDNA（完整的编码序列），提供特定多肽信息； 2）适当的表达载体。 产物特征： 1）原核细胞中缺乏真核基因表达装置（如，RNA剪接因子等），不能有效地进行翻译后修饰而不稳定； 2）活性受限或无活性。 （二）真核细胞基因在真核细胞中表达 真核细胞如酵母或昆虫细胞作为宿主细胞,提供一个相似但又不相同的基因表达环境。 产物特点:具有翻译后加工如糖基化等有利于蛋白的稳定和功能活性。 应用：大量制备真核细胞蛋白质， 研究特定基因表达。 五、基因文库 (DNA文库) DNA文库（DNA library)：指通过DNA克隆(重组)技术人工构建的包含某一特定来源DNA所有片段的重组DNA克隆总和。 DNA来源不同：可构建不同的DNA文库。 1. 基因组DNA文库 2. 染色体特异的基因文库 3. cDNA文库（cDNA library） 基因组DNA文库:应用DNA重组技术构建的含有基因组全部DNA序列的DNA克隆总和。 DNA来源：人类几乎所有细胞的核基因组DNA相同，可用易得到的外周血细胞DNA制备基因组DNA文库。 用途：该文库包含人类所有DNA序列。用核酸杂交技术从中筛查和分离目的基因。 构建基因组DNA文库 筛查含有目的基因的细胞克隆 染色体特异的基因文库（chromosome specific library） 单个染色体 →细胞克隆 （流式细胞仪） ↓ 细胞 → 染色体 染色体DNA文库 染色体区带 → 区带特异 (显微切割） ↓ DNA文库