酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用ppt课件.pptVIP

试验原理 采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的卡那霉素将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗卡那霉素抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与残留物卡那霉素的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中卡那霉素的含量。 操作步骤 1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(20-25℃)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。 2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。 3、洗涤工作液在使用前也需回温。 4、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。 5、加标准品/样本：加入标准品/样本20ml 到对应的微孔中，加入酶标二抗50ml/孔，再加入抗体工作液80ml/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应40min。 6、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250ml/孔，充分洗涤4－5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干。 7、显色：加入底物液A液50ml/孔，再加底物液B液50ml/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中避光反应15min。 8、测定：加入终止液50ml/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定每孔OD值。 定量分析 （1）百分吸光率的计算 标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即 百分吸光度值（%）＝B/B0×100% B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值 B0—0ppb标准溶液的平均吸光度值 （2）标准曲线的绘制与计算 以标准品百分吸光率为纵坐标，以卡那霉素标准品浓度（ppb）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中卡那霉素实际残留量。 卡那霉素测定方法验证 检测方法和标准曲线 竞争ELISA法测定药盒卡那霉素标准品 卡那霉素在样品溶液中的回收率 试验浓度 (ppb) 回收率 (%) Mean (%) CV (%) 20.0 97.55 95.11 98.71 99.15 101.84 97.69 98.34 2.25 5.0 95.79 82.90 88.29 103.64 98.72 88.42 92.96 8.31 1.0 88.52 89.67 89.41 89.41 92.40 86.14 89.26 2.26 卡那霉素在样品稀释液中的回收率(n=6) 精密度试验 试验浓度（ppb） 20.0 5.0 1.0 实测值 准确度(%) 实测值 准确度(%) 实测值 准确度(%) 板内Ⅰ 25.55 102.20 4.92 98.35 0.99 99.21 24.85 99.41 5.12 102.38 1.07 107.07 25.76 103.06 4.93 98.62 0.89 89.42 25.37 101.50 4.61 92.28 0.87 87.09 24.71 98.86 5.34 106.73 0.98 98.39 25.80 103.20 4.97 99.31 0.88 88.19 Mean 25.34 101.37 4.98 99.61 0.95 94.89 CV(%) 1.81 4.81 8.36 板内Ⅱ 24.94 99.76 5.60 112.05 0.90 89.54 24.61 98.45 5.51 110.26 0.94 94.38 25.42 101.67 5.15 103.09 1.00 99.62 25.42 101.67 4.74 94.72 1.06 106.39 24.33 97.31 4.72 94.30 0.99 98.89 23.77 95.06 5.05 101.01 0.88 88.37 Mean 24.75 98.99 5.13 102.57 0.96 96.20 CV% 2.61 7.32 7.08 板间CV(%) 2.47 6.11 7.43 卡那霉素稀释样本竞争ELISA法分析精密度试验结果(n=6) 四、人胰岛素原残留检测 Mercodia Proinsulin ELISA kit 目前重组人胰岛素生产主要以E.coli表达人胰岛素原，初步纯化后变复性，经胰蛋白酶(trypsin)和羧肽酶B(carboxypeptidase B)协同酶切，去掉前导肽和C-肽，