scraav8kallistatin治疗肝癌临床前药效学研究-preclinical pharmacodynamic study of scr aa v8 kalilistatin in the treatment of hepatocellular carcinoma.docxVIP

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scraav8kallistatin治疗肝癌临床前药效学研究-preclinical pharmacodynamic study of scr aa v8 kalilistatin in the treatment of hepatocellular carcinoma

学位论文独创性声明本人声明兹呈交的学位论文是本人在导师指导下完成的研究成果。论文写作中不包含其他人已经发表或撰写过的研究内容,如参考他人或集体的科研成果,均在论文中以明确的方式说明。本人依法享有和承担由此论文所产生的权利和责任。论文作者签名:签名日期:学位论文版权使用授权声明本人同意授权华侨大学有权保留并向国家机关或机构送交学位论文的复印件和电子版,允许学位论文被查阅和借阅。本人授权华侨大学可以将本学位论文的全部内容或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。论文作者签名:指导教师签名:签名日期:签名日期:摘要原发性肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)简称肝癌,发病率和死亡率都很高恶性肿瘤之一,传统抗癌药物普遍存在药效短、见效慢、需要多次给药的问题,而基因治疗带来了新希望。重组腺相关病毒(recombinantadeno-associatedvirus,rAAV)载体因其具有在体内外长期高效表达、免疫原性低等优点,被广泛应用于临床试验并取得了良好疗效。此外,与研究较深入的单链AAV2相比,AAV8具有免疫原性低、肝脏靶向性强的优势,自身互补型AAV(self-complementaryAAV,scAAV)具有高效快速表达的特点,因而scrAAV8被认为是肝脏相关疾病基因治疗最具前景的载体。Kallistatin(KAL),一种内源性血管生成抑制因子,不仅能抑制血管生成、血管舒张,还具有显著的抗氧化、抗炎症及抗肿瘤的多重功效。研究表明,ssrAAV2-KAL可显著抑制肝癌的增殖,本研究以scrAAV2-KAL做比较,探讨scrAAV8-KAL在体内外对肝癌治疗作用,寻求一种更安全有效、靶向性更强的肝癌治疗基因药物,为临床应用提供依据。scrAAV-KAL抗肿瘤、抗氧化应激和抗血管生成作用分三部分进行如下研究:本研究首先选取易于定量检测的Gaussialuciferase(Gluc)作为报告基因,制备两种参比scrAAV2/8-Gluc,同时生产自身互补型scrAAV2/8/9-KAL和单链ssrAAV8-KAL四种基因药物,以HUVEC、人源肝(癌)细胞为研究对象,对rAAV的转导效率进行筛选。Elisa检测转染后细胞上清中KAL的表达,scrAAV8在肝癌细胞中高表达,与scrAAV8相比,scrAAV9在多数细胞内转导效率低,ssrAAV转导效率较高,scrAAV2在HUVEC、肝正常细胞高表达;体外检测基因药物对HUVEC、肝(癌)细胞增殖、周期的影响,结果表明其对肝正常细胞没有明显影响,但是提高HepG2肝癌细胞S期比例,明显抑制HUVEC/SMMC-7721细胞活力,将细胞周期阻滞在G0/G1期;划痕法、WesternBlot和小管形成实验结果显示:scrAAV8组可以明显抑制SMMC-7721迁移、上皮间质转化,四种药物均能抑制HUVEC小管形成能力;基因药物预处理可以提高氧化应激损伤后HUVEC、HepG2细胞活力、ROS水平和超氧化物岐化酶SOD、谷胱甘肽还原酶GSH-px活性、总抗氧化能力,I抑制乳酸脱氢酶LDH释放;本研究最后进行体内药效学实验,不同免疫背景小鼠(Balb/c、C57BL/6)体内以不同血清型、剂量、给药途径给药,36周后血清中KAL依然高表达,scrAAV8尾静脉注射组的血清以及肝脏内kal表达量最高。基因药物对HepG2肝癌皮下移植瘤的增殖、侵袭具有抑制作用,scrAAV8-Kal作用大于scrAAV2-Kal。基因药物可以选择性杀伤HUVEC、肿瘤细胞,抑制其增殖、迁移,对肝正常细胞没有显著作用,并通过抗氧化应激作用保护细胞,scrAAV2-KAL对HUVEC作用明显,scrAAV8-KAL对肝癌细胞作用更为显著;体内scrAAV8-KAL对肝脏转导效率更高,能更有效地抑制肝癌的增殖、侵袭。综上所述,本研究结果为肝癌的临床前研究提供了有力的实验支持,而且scrAAV8-KAL是一种前景看好的临床试验基因候选药物。关键词:基因治疗肝细胞癌腺相关病毒KallistatinAbstractPrimaryhepatocellularcarcinoma(HCC)isoneofmalignanttumorsbecauseofitshighmorbidityandmortality.Traditionaldrugsmayhavemanyproblemssuchasshortefficacy,sloweffectandmultipledoses.Genetherapyhasbroughtnewhopecurrently.Therecombinantadeno-associatedvirus(rAAV)vectorhavebeen

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