sfrp5 mrna在大鼠骨骼肌挫伤组织中表达规律的研究-study on the expression of sf rp5 mrna in skeletal muscle contusion tissue of rats.docxVIP

SFRP5mRNA在大鼠骨骼肌挫伤组织中表达规律的研究摘要目的：在肌肉损伤后差异表达基因筛选的基础上，应用Real-timePCR技术检测大鼠肌肉挫伤后组织中分泌型卷曲相关蛋白5(secretedfrizzled-relatedprotein5，SFRP5)mRNA在肌肉组织中的表达情况，并分析其与挫伤时间、损伤类型和挫伤程度的关系，以及SFRP5mRNA在肌肉损伤修复过程中的作用，为法医病理学和法医工作中，推断损伤时间提供依据。方法：(1)动物分组：132只成年的Sprague-Daley大鼠，按随机分配的原则将大鼠分为以下6组：A组：正常对照组（n=6只）；B组：损伤组（又可分为12组：分别为4h、8h、12h、16h、20h、24h、28h、32h、36h、40h、44h和48h组）（n=6只）；C组：对侧组（损伤组的对侧未损伤组织24h、36h和48h）（n=6只）；D组：不同损伤程度组（共4组：轻伤组4h和8h，重伤组4h和8h）（n=6只）、E：死后组（共3组：死后12h、18h和24h）（n=6只）、F：切创伤组（共2组：4h和8h）（n=6只）(2)模型制备：A组：正常对照组：将正常大鼠无痛处死，取其右后肢骨骼肌做检材；B组：损伤组：用自由落体的方法打击大鼠的右后肢骨骼肌，分别在伤后规定的时间点将大鼠无痛处死，在损伤的位置进行取材；C组：对侧组：在损伤组的24h、36h和48h三个时间点的左侧骨骼肌进行取材；D组：不同损伤程度组：将重力锤从200cm和130cm高度处分别自由落下，并分别于损伤后的4小时和8小时两个时间点进行取材；E组：死后组：将大鼠无痛处死以后，在工气候箱中保存，然后在规定的时间点于大鼠右侧后肢相同部位进行取材；F：切创组：将大鼠右后肢内侧皮肤全层切开，切割骨骼肌以制作切创模型，并将其于切创后4小时和8小时两个时间点无痛处死，并取材。(3)根据InvitrogenTRIzolReagent试剂盒的操作说明，对总RNA进行提取，并测得样本总RNA的OD260/OD280的比值，同时对核酸的纯度也进行评价。(4)总RNA逆转录合成cDNA，以RPL13mRNA看家基因为内参进行Real-timePCR检测，结果以2-△△Ct的方法来计算各实验组与正常对照组之间SFRP5mRNA的相对表达量。结果：(1)经TRIzolTeagent试剂提取的总RNA样本其OD260/OD280比值均在1.8～2.2之间。(2)SFRP5mRNA与RPL13mRNA的扩增效率分别为110.5%和120.2%，相关系数分别为0.995和0.982，说明二者的扩增效率基本一致，可以认为RPL13mRNA能用作SFRP5mRNA的内参基因。(3)在大鼠肌肉挫伤后48小时内SFRP5mRNA的相对表达量均降低，且随着时间的变化呈现出先降低后增高的趋势。在肌肉挫伤后的4、8、12、16和20小时SFRP5mRNA表达量分别为正常组的65.0%、44.6%、36.1%、31.4%、22.3%，之后在24、28、32、36、40、44和48小时SFRP5mRNA表达量分别为对照组的26.3%、36.3%、37.2%、47.3%、50.4%、61.8%、68.8%。与正常对照组相比，其表达变化量在22.3%-68.8%之间波动。(4)与正常对照组相比较，同一只大鼠的对侧未损伤肌肉组织中SFRP5mRNA的表达量无统计学差异(P0.05)，由此可以推测，在采用SFRP5mRNA进行损伤时间推断时，其自身对侧未损伤部位的肌肉组织可以做为正常对照对损伤区域表达量进行相对定量分析。(5)在轻度损伤和重度损伤SFRP5mRNA均出现下调，但其各自的重伤和轻伤SFRP5mRNA的相对表达量之间相比，无统计学差异(P0.05)，说明SFRP5mRNA的相对表达量与损伤的程度无关。(6)SFRP5mRNA在死后组的表达量与对照组相比差异无统计学意义(P0.05)，由此可以推测，在死后的24小时之内SFRP5mRNA的表达水平相对来说仍然比较稳定，即在死亡后的24小时以内，并不会对损伤时间的推断产生影响。(7)切创组与挫伤组SFRP5mRNA的表达量与正常对照组相比，都明显的降低，但在伤后4小时，切创组与挫伤组存在明显差异，而在8小时切创组与挫伤组SFRP5mRNA的表达差异不明显；结论：分泌型卷曲相关蛋白5mRNA仅在损伤处肌肉组织中其表达量呈现出先下降再升高的变化趋势，还没有发现其变化趋势和损伤程度相关联，是否与损伤的类型有关联还需要我们做进一步的研究，且SFRP5mRNA在死后24小时以内未发生明显降解，有望成为损伤时间推断的指标之一。关键词：法医病理学；损伤时间推断；实时定量PCR；SFRP5mRNA；挫伤ExpressionofSFRP5m