新型分子信标的合成及其性能分析-synthesis and performance analysis of novel molecular beacon.docxVIP

湖南大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1、保密√，在1年解密后适用本授权书。2、不保密□。（请在以上相应方框内打“v”）作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日第1章绪论人类的身体构造如同一部复杂的机器，和谐的运转中蕴藏着无限的神奇，人们对生命现象的研究和理解，经历了一个从宏观到微观的过程。1953年Watson和Crick提出了DNA双螺旋结构的经典模型[1]，标志着现代分子生物学的诞生，基因组学迅速成为分子生物学领域的研究热点，人们不断设计合成出各种不同类型的核酸分子探针来适应生命科学不断发展的需要。但早期的核酸分子探针的制备十分复杂，需要以天然的核酸链为模板，采用PCR扩增、逆转录或克隆等方法制备，整个过程十分费时费力，大大阻碍了分子生物学的研究进展。直到60年代洛克菲勒研究所发表了经典的固相合成方法[2]，这种情况才得以改观。固相合成法最初是用于多肽的合成，Merrifield将第一个氨基酸固定在不溶的聚合物载体上，然后将其他氨基酸逐个连接到固定的目标上，从而得到所需要的氨基酸序列，合成完毕后，将氨基酸序列从固体支持物上切割下来，进行纯化得到目标多肽序列。该方法对人们研究激素、酶、多肽药物等具有划时代的意义。由于Merrifield在该研究领域的杰出贡献，当之无愧地得到了1984年的诺贝尔化学奖。该方法报道不久就被用于DNA化学合成当中[3,4]，由其演化而来的核酸自动合成仪的诞生为核酸分子探针的发展注入无尽的动力，真正突破了以前DNA化学合成费时费力的瓶颈。经过20多年不断的发展，目前DNA的合成已经变得比较简单易行[5]，人们几乎可以随意设计合成自己需要的核酸序列，这迅速拉开了人们大规模研究核酸分子探针的序幕。DNA化学合成原理目前，一般DNA合成都采用固相亚磷酰胺三酯法[6]合成DNA片段，此方法具有合成速度快、偶联效率高等优点，已在DNA化学合成中得到广泛应用。1.1.1DNA的结构和化学性质对合成的影响DNA的合成对环境、原料要求很高。DNA合成单体以亚磷酰胺形式存在[7]，由于其极易水解，所以DNA合成过程当中应该严格防水。单体中磷酸二酯键氧阴离子和环外一级氨基必须加以保护，因为这些基团是主要的亲核中心，将干扰核苷酸脱氧核糖的羟基与另外一个核苷酸磷酸基的反应，而且杂环碱基容易参与许多化学反应，甚至最弱的氧化剂都可以引起腺嘌呤、胞嘧啶形成N-氧化物，或者更严重的破坏[8]。杂环上所有的氮及氧原子都是潜在的亲电进攻部位，且杂环上绝大多数的非桥键都是水解的进攻部位，因此要避免用酸和强碱水溶液，弱酸也会能使得嘌呤脱氧核苷的N-C’1糖苷键不稳定，导致脱嘌呤效果[8]。因此DNA合成过程当中一定要注意避免引起碱基脱落。DNA的一级结构是磷酸二酯键通过3’-5’连接而成的2-脱氧-D-核糖环链。结构中存在可解离的磷酸部分以及胞嘧啶，腺嘌呤，鸟嘌呤上环外一级氨基，因此它具有良好的水溶性，该特性使DNA的纯化必须在水溶液中进行，多离子特性使其可被离子交换色谱或电泳利用。同时由于一级氨基具有形成氢键的能力，以及碱基的堆积力，DNA在合成过程中会形成二级结构，这对DNA最后的纯化造成一定的困难，需要采用较强的变性条件[9]。DNA合成固相支持物较常用的DNA合成载体是控制微孔玻璃珠[10]（controlledporeglass,CPG）。CPG通过一个硅氧烷键将一个连接臂固定在其表面，核苷的3’-OH通过琥珀酸酯键共价的连接到CPG表面的连接臂上，5’-OH被-DMTr基团封闭。该琥珀酸酯键对碱不稳定，可以用氨水对其进行水解，从而使合成出来的DNA序列脱离CPG。目前市面上有两大类CPG出售：已经连接一个碱基的常规CPG和没有连接碱基的通用CPG。相比较而言，通用CPG使用起来更为灵活，在大规模合成中更为方便。OCH3ROOOOBODMTOOCH3OCCH2CH2CNHCH2CH2CH2OOSiONHNOHCPGO（A）(B)图1.1CPG结构示意图（A）为常规CPG；(B)为通用CPGFigure1.1ThesketchmapofCPG（A）No