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免疫组化IHC/ICC/ISH主要内容1 免疫组化的概念2 免疫组化的步骤3 免疫组化的应用免疫组化的概念免疫组化免疫组化（IHC）：原位示踪染色技术原理： 用荧光素、生物素或地高辛等标记的抗体（或抗原）对细胞或组织内的相应抗原（或抗体）进行定性、定位或定量检测，经过组织化学的呈色反应之后，用显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察。IHC/ICC/ISH抗体的标记 为了使抗原-抗体可见，必须将抗体标记，利用标记物与其他物质的反应将阳性结果放大，并转换成可见的荧光或呈现出颜色。免疫组化常用/view/1494103.htm标记物① /view/2062542.htm荧光素：最常用的是异硫一/view/601219.htm氰酸荧光素（FITC）-呈绿色荧光；四乙基罗达明（rho—damine RB200）-橙红色荧光。② 酶：辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）。③ 生物素：（Biotin）④铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用）染色方法1.直接法用标记物（荧光素，酶等）直接标记在一抗上，标记抗体与抗原结合。在通过显色或者荧光激发后在显微镜下观察；2.间接法荧光素，酶标记在二抗上（二抗：抗产生一抗动物的 IgG抗体）。3.非标记Ab桥法桥法”是/view/857183.htm酶标记抗体的改进，经过三次抗体，其二抗为未标记桥抗体。4. ABC法（/view/556994.htm亲和素—生物素—过氧化物酶复合物法）等等间接法酶桥法直接法桥抗体抗酶抗体与过氧化物酶复合物ABC 复合物ABC 法石蜡组织切片的制备1.取材：从动物或者患者取下组织材料。2.固定：将所需要的材料进行固定，使得组织内蛋白质迅速凝固液（甲醛），细胞内结构和成分不再发生改变。3.脱水：固定后的组织内进行脱水，以便石蜡的浸入。脱水用梯度酒精进行脱水。（自动脱水机）4.浸蜡与包埋：组织放置刚过熔点的石蜡中，然后进行包埋，将透明后浸了蜡的组织块放到盛有熔化石蜡的模块中，并使之凝固成蜡块。（包埋机）5.切片与贴片：（ 组织切片机）（1）切片 （2）展片 （3）贴片免疫组化染色（石蜡切片）1.烤片 65℃ 1-2h2.常规二甲苯脱蜡，和梯度酒精水化3.灭活内源性过氧化物酶4.抗原修复5.封闭6.一抗过夜7.加入有标记的二抗8.显色9.苏木素复染10.常规梯度酒精脱水，透明，干燥 ，封片。免疫组化应用在临床上的应用在科研中的应用在临床上的应用：在肿瘤病理学的研究和诊断中的应用1、确定肿瘤的分期2、鉴定病变性质3、对肿瘤细胞增生程度的评价4、发现微小转移灶5、了解肿瘤的分化程度6、指导肿瘤的治疗及预后7、辅助疾病的诊断和分类8、寻找感染病因免疫组化主要是检测相关的分子标志物对疾病作出评估在科研中应用 在科研研究某个基因与疾病的发生、（肿瘤)临床分期，预后，患者生存率等的相关性。最终的目的是考察这个基因的临床意义。免疫组化结果分析方法阳性标记的形态特征和判断：全面判断免疫组化，包括定性、定位和定量三个方面。定性：显色有无定量：显色强度及阳性细胞密度定位：阳性细胞着色形态及组织分布特点1）阳性标记免疫特征弱（+）中（++）强（+++）免疫荧光（FITC）：浅绿色、明显绿色和亮绿色耀眼荧光；免疫酶标记（HRP-DAB）:浅黄色，棕黄色和褐黄色；2）阳性标记细胞学特征：胞膜；胞核；胞浆型；微绒毛型；复合型（胞核-胞浆等。。。）3）阳性标记组织分布：局灶型；弥散型；片块型；网状型；腺管型等3）阳性标记强度特征：人工评分；详见肿瘤分子生物学与细胞生物学实验手册HE染色原理：苏木素染细胞核呈现深蓝色；伊红染料染细胞浆而呈现淡红色；目的：显示组织或细胞成分与病变的一般形态结构特点原位杂交 将标记物（荧光素；地高辛）标记寡核苷酸（探针），利用碱基互补配对将组织或细胞中目的核酸可见化。HE染色免疫组化/原位杂交免疫荧光谢谢在5-10 视野中