构建产纤维素酶的酿酒酵母工程菌群研究（可编辑）.doc

构建产纤维素酶的酿酒酵母工程菌群研究 1 :. .. 2 摘要 随着人类经济的不断发展,能源问题成为当今世界发展过程中最严重的几个问题之 一。利用产量大、来源广的纤维质原料生产乙醇对于开发新型能源具有重要的现实意义。 但目前木质纤维资源的利用率普遍较低,成本偏高,因此构建产纤维素酶的工程菌,并实 现纤维类生物质的水解和全糖发酵产乙醇一步完成,是目前纤维乙醇研究的主要方向。本 论文针对目前在酿酒酵母中表达纤维素酶的一些问题,依据生物信息学和分子生物学的理 论,运用体外定向进化技术,进行构建产纤维素酶的酿酒酵母工程菌群的研究。 本论文首先应用生物信息学的相关工具对里氏木霉已公布的条蛋白序列进行分 析,预测出条分泌蛋白,并通过功能预测发现里氏木霉的分泌蛋白中糖苷水解酶占很 大比例,其中,除了已经确定的条与木质纤维素降解相关蛋白序列之外,还有条蛋 白序列具有潜在的纤维素酶功能,从而开拓了里氏木霉的研究空间,更全面地掌握了里氏 木霉分泌蛋白中纤维素降解相关酶和蛋白的种类及序列特性,为之后纤维素酶基因的突变 和表达实验奠定了理论基础。 为了扩大纤维素酶基因的来源,在本实验室已从里氏木霉中得到包括内切葡聚糖酶 、、和,木聚糖酶和外切葡聚糖酶 的纤维素酶相关 基因的基础上,又通过的方法从黑曲霉中得到.葡萄糖苷酶基因,组成一个由多 种不同来源、不同功能、不同活性相结合的纤维素酶基因库,为进一步构建产纤维素酶的 酿酒酵母工程菌群提供了基因来源。 在此基础上,应用易错方法建立纤维素酶突变库,在酿酒酵母中进行 表达。为了提高纤维素酶活,建立了定向传代培养的方法,使用优化的筛选培养基对重组 菌进行培养,最终得到酶活达. ?的菌群和酶活达. ?‘的菌群, 酶活较出发菌分别提高了.%和.%,从而验证了定向进化培养方法的有效性。 本研究通过新方法的建立和菌群概念的提出构建产纤维素酶的酿酒酵母工程菌群,取 得一定成效,并为纤维乙醇的进一步研究提供了新的思路和方法,为实现酿酒酵母直接利 用纤维素产乙醇奠定了基础。 关键词:酿酒酵母纤维素酶工程菌群体外定向进化技术3 ,., ,., 曲. .,., .,.‘ .,, , ,, . .,.,., .?~ .?~, . 4 .% .% . ,,.: ;;; 5 目录摘要? 第一章绪论??。 .纤维素酶的研究进展..纤维素酶简介??。 ..纤维乙醇的研究概况??一 ..纤维素酶的基因工程研究进展?. .体外定向进化技术概述? ..常用的体外定向进化技术. ..体外定向进化技术的意义和应用.. .酿酒酵母工程菌群 .本论文的研究内容 第二章纤维素酶系基因的生物信息学分析?.. .引言?。 .数据库和分析工具 ..真核生物基因组数据库??。 ..预测工具?. ..其他分析工具..分析流程? .结果和讨论??. ..里氏木霉分泌蛋白功能预测结果 ..里氏木霉纤维素酶系相关基因的比对结果.本章小结. 第三章相关纤维素酶基因的获得和初步表达? .引言? .实验材料和方法.. 6 ..材料.. ..方法?一 .结果和讨论??.. ..里氏木霉纤维素酶基因的扩增?. ..黑曲霉.葡萄糖苷酶基因的获得和表达 ..酶活的测定. .本章小结? 第四章体外定向进化法构建产纤维素酶的酿酒酵母工程菌群??.. .引言 .实验材料和方法. ..材料 ..方法 .结果和讨论??. .定向培养条件的优化..突变基因的表达? ..定向培养? .本章小结? 第五章结论与展望.. .结论? .展望??一 参考文献附录?.. 成果??。 致谢7 硕士学位论文 第一章绪论 随着人类经济的不断发展,资源、能源和环境问题变得越来越重要。传统的化石资源 正在以前所未有的速度耗尽,能源问题成为当今世界发展过程中最严重的几个问题之一。 资源的高效利用和新型能源的开发成为人类的重要课题。其中,可再生能源的开发与应用 是解决资源、能源和环境问题的重要策略。生物能源,作为一种新型清洁的可再生能源, 对解决能源危机和缓解环境问题有重要意义。 木质纤维素是地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物,包括木质素、纤维素和半 纤维素三种。每年植物的干物质生成量高达亿吨,其中纤维素的含量超过%。 在我国,大部分木质纤维素没有得到有效利用,而是通过微生物自然分解,参加自然界碳 素循环。农作物中大量的秸杆长期以来被作为废弃物焚烧处理,在浪费资源的同时,还造 成了环境污染。如能有效降解木质纤维素并将其转化为人类所需的能源、食物和化工原料, 对于解决环境污染、食物短缺和能源危机具有重大的现实意义。 .纤维素酶的研究进展 目前纤维素的降解以生物酶法最佳,即纤维素酶法,纤维素酶一方面可将纤维素水解 成葡萄糖等有效成分,另一方面它可以通过提高植物细胞壁的通透