基因工程基本操作程序1.pptxVIP

;;目的基因的获得方法;1）从基因文库中获取目的基因：;;用DNA探针从基因文库中准确提取 目的基因 把DNA分子双链解开，根据所需的基因核苷酸序列制成一段与之互补的核苷酸短链，并用同位素标记，即成探针。用这一探针查基因文库中已经解旋的DNA片段，如果有一片段与探针片段发生互，这一片段就含有所需的的基因。; 用DNA重组技术将某种生物的总DNA用特定的限制性内切酶切割成一个个片段，然后将这些片段随机地连接在某些质粒或其他载体上，再将它们转移到适当的宿主细胞中，通过细胞的增殖而构成各个片段的无性繁殖系（克隆），当这些克隆多到可以包括某种生物的全部基因时，这一批克隆的总体就称为该种生物的基因文库。这一定义也适用于线粒体DNA和叶绿体DNA，分别称为某种生物的线粒体基因文库或叶绿体基因文库。为了有效地保存基因文库，可通过细菌在固体培养基上繁殖而使包含各个特定DNA片段的细菌增多。通过分子杂交的方法，可以筛选出包含有所需基因的DNA片段的细菌（或噬菌体）。经过扩增得到大量这样的细菌（或噬菌体），从中便可分离出所需基因的DNA片段。建立和使用基因文库是分离高等真核生物基因的有效手段，对于基因定位和基因工程的研究都很有用。; 2）人工合成;哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？;PCR——聚合酶链式反应 扩增过程：加热DNA变性解旋 引物与单链互补结合 在DNA聚合酶作用下进行延伸 （指数形式扩增。）;;基因表达载体的构建 目的基因 启动子 位置：基因的首端 功能：RNA聚合酶识别和结合的 组成 部位，驱动基因转录mRNA 终止子 位置：基因的尾端 功能：终止转录 标记基因 ： 鉴别受体细胞是否有目的基因;;步骤二：基因表达载体的构建;;①直接导入法有电击、显微注射、直接吸收、基因枪等方法。 （1）电击法：借助电击仪高压脉冲把目的基因打入宿主细胞。 （2）显微注射法：利用微量注射器在显微镜下直接把目的基因注入宿主细胞。 （3）直接吸收法：把目的基因和宿主细胞混在一起，让其吸收。 （4）基因枪法：在金属微粒上涂一层目的基因，然后发射到宿主细胞中。 ②间接导入法常用的载体是质粒、λ噬菌体、科斯质粒。 （1）质粒是细菌染色体DNA以外的环状双链DNA分子，它能自我复制，也可整合到细胞染色体DNA中与其一起表达。质粒通常还含有标记基因，这可以从细胞的表型特征来识别。 （2）λ噬菌体是一种细菌病毒，其环状双链DNA可以作为目的基因的载体。 （3）科斯质粒是一种杂种质粒，含有质粒和λ噬菌体的部分顺序，很适合用作真核生物基因的载体。;1.将目的基因导入植物细胞;2.将目的基因导入动物细胞;3.将目的基因导入微生物细胞;;步骤四：目的基因的检测与鉴定;四、目的基因的检测与鉴定;思考：检测mRNA 是否合成，可以用分子杂交的方法吗？; 不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。;　　前三步的处理十分繁锁，为保证目的基因得到有效利用，通常用大量的受体细胞来接受不多的目的基因。这样，处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。;　　多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一步培养、研究。;寻根问底—— （1）为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？;寻根问底：将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？;1.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？;（1）从小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。 （2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。 （3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明β-珠蛋白基因已进入其中。 （4）培养进入了β-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取β-珠蛋白。 ;思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗