细胞色素blt;,5gt;向细胞色素c的结构转化以及分歧表达体系对其结构、性质和功能的影响.pdf

摘 要 血红素蛋白是一大类含有原卟啉IX(血红素，heme)作为辅基的金属蛋白， 在生命体系中执行着重要的生物功能，如氧载体功能(血红蛋白，Hb和肌红蛋 白，Mb)，电子传递功能(细胞色素bj，cyt C等)，生物催 bj和细胞色素C，cyt P450和细胞色素c过氧化物酶，CcP等)，以及生 化功能(细胞色素P450，cyt 不同的蛋白分子所利用，来执行不同的生物功能，一直是化学生物学和蛋白质化 学研究领域所关注的重点，人们正试图对这一问题进行解答来认识金属蛋白结构 一性质一反应一功能之间所蕴含的精妙关系。 b5是血红素蛋白中电子传递蛋白的典型代表，其辅基heme与蛋白肽链 Cyt 的结合是以非共价键的方式进行的，结合能力主要来自heme轴向双组氨酸His39 b5与cytC不同，后者辅基 和His63的配位作用，以及氢键和疏水作用等。Cyt (CXXCH)中的半胱氨酸形成了两个硫醚键，因而以共价键的方式相互结合。 b5分子中辅基heme有着更大的溶液暴露程度。 同时，与cytC或Mb相比，cyt bj具有较低的辅基结合稳定性。 这些原因直接导致了cyt b5轴向配体的研究相对较少，这 纵观cytbj的研究历程，我们发现关于cyt bj的辅基结合能力，以 主要是因为heme轴向配体的突变会很大程度上降低cyt b5复杂得多，往往需要投入很多时间和精力，才能获得足够纯度的蛋白用 纯eyt 于进一步实验研究。 然而，关于血红素蛋白结构、性质和功能的很多研究，正是集中在活性中，tl, b5辅基结合的稳定性，以及如何 辅基heme的轴向配体上。因此，如何提高cyt b5轴向 bj的分离纯化方法，特别是如何使用简便的提纯方法来获得cyt 简化cyt 突变体的apo．protein，是一系列值得研究与探索的课题。 c中所具有的结合heme的结构片段域CXXCH， 由于cytb5中并不存在cyt C中的硫醚键。通过 而且整个蛋白肽链中并不存在Cys，因此无法形成类似cyt 2一乙烯基和4一 对cytb5晶体结构信息作仔细深入地研究后，我们发现距离heme 乙烯基0c碳原子的距离分别为4．32和3．86A。这样的距离很适合共价键的形 成，如果将这两个位点的氨基酸残基分别用Cys取代，在蛋白表达的过程中，所 C 引入的Cys极有可能分别与heme的两个乙烯基发生加成反应，形成类似cyt 中的硫醚键。因此，我们运用定点突变的方法构建了cytbjN57C、cytb5$71C bjN57C／$71C突变体，并对其进行了性质表征。 以及cyt 研究证明，在cytb5分子中heme乙烯基附近适当的位置引入半胱氨酸，通 过体内表达的方法，的确可以实现辅基heme与蛋白肽链的共价键合。所引入的 差别主要取决于所引入半胱氨酸与heme乙烯基之间的距离，乙烯基自身的取向， C中所特 以及各自所处的微环境等因素。研究结果也表明并不需要构建类似cyt