新型冠状病毒实验室诊断方法学研讨.pdf

摘要 摘 要 2002年11月，中国广东省出现了首例传染性非典型肺炎患者，世界卫生组 织根据临床症状于2003年3月15日将其命名为严重急性呼吸道综合症—— SevereAcute Respiratory 果，正式宣布SARS的病原体为一种变异的新型冠状病毒(正单链RNA病毒， SARS CoV)。其后，WHO公布的资料显示，全球共计出现非典病人和疑似病人 8450例，其中死亡784人，涉及33个国家和地区。由于其病征与感冒、腹泻等 常见病病征相似，容易造成临床上的疑诊和误诊。因此，开展相关检测方法和试 剂的研发，提供对SARS的早期诊断结果，是进行疾病预防、阻断传播、保护人 类自身的首要措施之一，是世界性医学和社会的重大课题。 CoV 近两年的研究表明，SARS S蛋白的受体已经很清楚(ACE2)，是病毒 的主要保护性抗原，N蛋白和M蛋白也可以诱导免疫效应，是检测病毒抗体的 良好抗原。本研究根据基因扩增、克隆表达和酶联免疫技术，结合生物信息学、 F6ster等理论，以基因工程、荧光探针、高效核酸杂交等先进技术手段，提出了 简单二级结构高熵值靶序列、空间压缩荧光／淬灭、反转录／抗污染整合等新思路， 克服了荧光探针背景过高、RNA提取效率低、阳性对照具有潜在传染性／不稳定、 反转录和抗污染不能兼顾等技术难题，取得了特异、适合检测的靶序列和引物、 TaqMan-BC探针、高效提取方法、病毒样颗粒阳性对照和内对照、反转录／UNG 基因检测、酶免抗体检测等方法和试剂，是SARS早期鉴别诊断、病程监测、预 后和流病调查的重要手段，社会意义巨大。 一、根据生物信息学理论，将核酸序列简单二级结构新思路引入靶序列的选择上。 并根据基因组信息分析结果，获得了适合基因检测的高熵值靶序列；成功地设计 了独特的TaqMan-BC荧光探针，将实际检测本底降低2倍以上； 二、建立了高效简便的核酸提取方法，巧妙设计了反转录脚NG抗污染、eDNA 富集、扩增一体化组合的反应体系，在有效提高灵敏度的同时彻底解决了PCR 实验过程中容易出现的污染问题，检测灵敏度达到45 Copies／mL。 三、整合了RT-PCR和快速核酸杂交技术，通过化学交连，将探针商效地固定在 郑州大学博士掌位论文 微孔板上，优化杂交方法，建立了快速、灵敏的酶免PCR检测方法； 四、成功地构建了含SARS基因片段和内对照片段的病毒样颗粒，其实际应用使 检测试剂无害化，避免了使用灭活阳性样本或病毒带来的潜在传染性，或使用 DNA／RNA带来的不稳定问题，实现了阳性对照和临床样本全程平行同步操作， 达到全程监控的效果，杜绝假阳、阴性出现；通过内对照也可校正不同反应之间 的差异，为准确定量提供了有力的工具： 五、克隆、表达、纯化了SARSCoV的N和M蛋白，并将其成功地应用于双抗 原夹心法酶免诊断试剂的研究。研究表明：HRP和抗原的最佳比例为1：1．5时， 其标记率可达O31；实验模式采用50止样品稀释液加50止样品混匀，37。C孵 育30rain，再加100 min，充分洗涤后加显色剂A、 uL酶标抗原，37。C孵育30 min，最后加50止终止液终止反应。全套试 4C暗处温育显色20 B各50HL于37 72 剂置37。C h破坏，灵敏度、特异性、稳定性和精密性仍达到国家标准； 六、成功地制备了抗M、N蛋白的抗体，实现抗体检测方法中阳性对照无害化， 避免了对人员和环境的潜在危害(整个生产过程中除质检使用灭活血清外，不接 触生物危害物质)i 七、采用重组抗原建立的双抗原夹心法酶免抗体检测方法对收集的402例标本进 行检测，结果表明SARS患者发病10天以上，检出率87％；发病31天以上， 检出率达936％。发热非SARS病人、非SARS的呼吸道疾病病人、医院其他非 SARS的临床标本、非SARS儿童标本、医务人员(密切接触者)及健康人标本 共2106份，检测均为阴性。 八、采用SARSCoV基因检测方法对收集的202份临床漱口液标本进行检测， 结果表明RNA阳性检出率为5