gcs通过影响bcl2的表达介导结肠癌细 胞的多药耐药-gcs mediates multidrug resistance of colon cancer cells by affecting bcl 2 expression.docx

原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研 究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：日期：年月日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。 根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部 门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州 大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学 位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑 州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：日期：年月日GCS 通过影响 BCL-2 的表达介导结肠癌细胞多药耐药研究生韩雪 导师宋敏郑州大学第一附属医院肿瘤科 河南郑州450052摘要背景与目的在现阶段，化疗依然是治疗终末期肿瘤的主要手段，而肿瘤细胞多药耐药 的形成是导致化疗失败的直接原因，导致预后不良。多药耐药（MDR）是指肿瘤 细胞在对某一种化疗药物产生耐药后，对其他化学作用原理不同、结构各异的 抗肿瘤药物产生交叉耐药的现象。神经酰胺在抑制肿瘤细胞增殖、促进凋亡方 面起着重要作用，而葡萄糖神经酰胺合成酶（GCS）可以催化神经酰胺糖基化生 成葡萄糖神经酰胺（GlcCer），从而可以逃避神经酰胺介导的肿瘤凋亡。越来越 多的证据表明，肿瘤细胞多药耐药的形成与细胞内葡萄糖神经酰胺合成酶水平 升高有着密切的关系。细胞中 ERK 蛋白的高表达可以促进抗凋亡蛋白 Bcl-2 的 表达上调，作用于细胞凋亡的下游共同通路，发挥抗凋亡作用，Bcl-2 的抗凋亡 作用已被证实参与肿瘤细胞多药耐药的形成，有文献报道，白血病耐药细胞中 存在 GCS 与 Bcl-2 的共同高表达[1]。但目前 GCS 与 Bcl-2 的关系及作用机制在 结直肠癌中报道甚少。本研究旨在通过检测结肠癌敏感株细胞 HCT-8、耐药细胞 HCT-8/VCR 及加 入 GCS 抑制剂 PPMP 后，各组细胞中 GCS、 Bcl-2 及 ERK 的表达情况，探讨 其相互关系及可能的作用机制。I方法1细胞株的培养1）HCT-8 组：结肠癌敏感细胞 HCT-8 在含 10%胎牛血清的 RPMI-1640 培 养液(含青霉素、链霉素各 100 U/mL)中常规培养，培养条件为 37℃、CO2 体积 分数为 5%、饱和湿度。至少培养 2 周后，取对数期生长良好的细胞进行实验。 2）HCT-8/VCR 组：结肠癌耐药细胞 HCT-8/VCR 在含 1.0μg/ml VCR 的培养 基中培养，以维持其耐药性。实验在脱药培养 2 周，取对数期生长良好的细胞进行。3）HCT-8/VCR+PPMP 组：HCT-8/VCR 细胞株脱药培养后，继续在含有20μmol/L PPMP 的培养基中培养 48h 后进行实验。蛋白质印迹法（Western Blot）收集 HCT-8 组、HCT-8/VCR 组和 HCT-8/VCR+PPMP 组细胞，提取总蛋白，Western Blot 检测各组细胞 GCS、 Bcl-2 及 ERK 蛋白的表达情况。荧光定量 PCR 法（RT-qPCR）收集 HCT-8 组、HCT-8/VCR 组和 HCT-8/VCR+PPMP 组的细胞，提取 RNA， RT-qPCR 检测各组细胞 GCS、 Bcl-2 及 ERK 基因的表达情况。结果1．结肠癌敏感细胞 HCT-8 及耐药细胞 HCT-8/VCR 中均有 GCS 和抗凋亡蛋 白 Bcl-2 的表达，耐药细胞株中 GCS 的表达高于敏感细胞株，差异显著（P＜ 0.05）；并且 Bcl-2 在耐药株中的表达也明显高于敏感株细胞（P＜0.05），与 GCS 具有一致性。2．HCT-8/VCR 组与 HCT-8/VCR+PPMP 组相比，加入 GCS 抑制剂 PPMP 后，明显抑制了 GCS 的表达（P＜0.05）；同时，在 HCT-8/VCR+PPMP 组抗凋 亡蛋白 Bcl-2 与 ERK 蛋白的表达较 HCT-8/VCR 组下降（P＜0.05）。3．RT-qPCR 检测 HCT-8/VCR 组与 HCT-8 组目的基因，结果显示：耐药组 细胞中 GCS、Bcl-2 及 ERK 基因都高于其亲本细胞组，且差异显著（P＜0.05）。 4．HCT-8/VCR 组和 HCT-8/VCR+PPMP 组相比，加入抑制剂组的细胞内IIGCS mRNA 的表达量明显低于 HCT-8/VCR 组（P