BCG激活淋巴细胞对膀胱肿瘤细胞株TBC-1杀伤作用实验研究.docVIP

BCG激活淋巴细胞对膀胱肿瘤细胞株TBC-1杀伤作用实验研究 　　【摘要】目的研究BCG激活的淋巴细胞对膀胱肿瘤细胞株TBC－1的杀伤作用。方法分离人外周血中的淋巴细胞，分别经BCG和IL－2刺激，检测淋巴细胞的增殖及其对TBC－1的杀伤活性。结果? 　　BCG刺激的淋巴细胞于不同效靶比40∶1、20∶1、10∶1对TBC－1的杀伤活性分别为（42.36±3.86）%、（29.19±2.39）%、（14.36±1.68）%。结论BCG刺激的淋巴细胞对膀胱肿瘤细胞株TBC－1有杀伤作用。? 　　【关键词】膀胱肿瘤;卡介苗;淋巴细胞 　　BCG为结核杆菌的减毒活疫苗，其主要成分是卡介苗核糖核酸，具有很强的非特异性免疫刺激作用，BCG可刺激人单个核细胞产生IL－2、IL－12、IL－6和IFNγ20,诱导辅助性T淋巴细胞(Th)、B淋巴细胞、天然杀伤细胞(NK)、活化的淋巴细胞、树突状细胞(dendriticcell，DC)表面的MHC.I类分子和协同刺激分子的表达均明显上调,其诱导的机体免疫反应是一种典型的Thl型免疫反应。? 　　本实验以活BCG刺激人外周血中的淋巴细胞，IL－2扩增诱导产生抗膀胱肿瘤效应细胞，研究BCG激活的淋巴细胞对膀胱肿瘤细胞株TBC－1的杀伤作用。? 　　 　　1材料和方法? 　　1.1BCG激活的淋巴细胞和LAK细胞的培养及增殖的测定 　　新鲜外周静脉血10ml，梯度密度离心法提取单个核细胞,静置1h，去除单核细胞，台盼蓝染色，活细胞数大于95%者，用含10%人AB血清的RPMI－1640完全培养基调整细胞浓度为1.0×10?6/ml。分别按7.5ug/ml(3.75×10?4CFU/ml)加入活BCG，按500u/ml加入IL－2，置37℃、5%CO?2饱和湿度下培养，3d换液1次，于第7天更换含IL－2500u/ml的RPMI－1640培养基，继续置37℃、5%CO?2饱和湿度下培养，每3d换液1次，于14d收获BCG激活的淋巴细胞，于7d收获LAK用于实验。继续培养，分别培养至30d，测定活细胞数。? 　　1.2BCG激活的淋巴细胞和LAK细胞对TBC－1的细胞毒作用测定 　　计算不同效靶比40∶1、20∶1、10∶1?BCG激活的淋巴细胞和LAK细胞对TBC－1的杀伤活性（MTT法）用酶标仪在检测波长492nm，参考波长650nm下测定OD值（492-650nm）。计算结果:杀伤活性(%)=［1－(实验组OD值－单独效应细胞组OD值)/单独靶细胞组OD值］×100%? 　　1.3统计学方法 　　全部资料结果以（x±s）表示，采用配对t检验，???用SPSS10.0统计分析软件进行统计分析。? 　　 　　2结果? 　　2.1BCG激活淋巴细胞与LAK细胞的增殖倍数比较 　　BCG激活淋巴细胞于培养的6、12、18、24、30d细胞增殖倍数分别为3.08±0.34、8.27±0.55、25.21±3.01、46.39±3.20、40.21±2.19。LAK细胞于培养的6、12、18、24、30d细胞增殖倍数分别为4.53±0.33、9.14±0.30、20.76±1.78、19.44±1.50、16.35±2.74。? 　　BCG激活淋巴细胞与LAK细胞的细胞毒作用比较? 　　BCG激活淋巴细胞与LAK细胞的细胞毒作用在效靶比10∶1时，差异无统计学意义。在效靶比40∶1、20∶1时，有显著性差异。? 　　 　　3讨论? 　　BCG的抗肿瘤活性与其能够激活NK细胞关系密切。有研究发现，连续四周给接种肿瘤的小鼠注射活的BCG能明显延长小鼠的生存期，而给NK细胞缺陷的小鼠注射BCG以及用单克隆抗体中和NK细胞表面分子NK1.1时均可导致BCG抗肿瘤活性消失［1］。? 　　膀胱癌患者的免疫功能低下，外周血IL－2及NK活性降低。提高患者的免疫功能，降低复发率就显得非常重要。NK细胞在机体免疫监视与杀伤肿瘤效应中起重要作用。BCG是NK细胞的强烈诱导剂与活性调节剂，在免疫调节网络中，BCG通过直接诱导、激活T、T4、NK、MΦ产生IL－2与IFN。后者可进一步刺激NK细胞增殖与分化，使前体NK细胞转化成具有强烈细胞毒效应的成熟NK细胞［2］。研究表明：BCG能上调膀胱肿瘤细胞表面MHC－Ⅱ类分子、CD1、CD80和ICAM－1的表达，而且经过BCG诱导的MBT－2细胞能够刺激淋巴细胞分泌IL2和IFN7，这些结果提示：膀胱肿瘤细胞经BCG刺激后获得了抗原递呈细胞的特点和功能［3］。有研究表明：BCG细胞壁是通过与TLR2和TLR4结合来刺激细胞因子的产生［4,5］。? 　　用结核杆菌感染TLR4缺陷的C3H／HeJ小鼠和TLR4表达正常的C3H／HeN小鼠，