SELDI-TOF-MS技术检测正常肾细胞株与肾癌细胞株差异表达蛋白.docVIP

SELDI-TOF-MS技术检测正常肾细胞株与肾癌细胞株差异表达蛋白 　　[中图分类号]R737.11　[文献标识码]A　[文章编号]1185-1672(2007)-08-0677-04 　　 　　摘要目的　分析体外培养的正常肾细胞株和肾癌细胞株的蛋白质表达差异。方法　运用表面增强激光解吸离子化蛋白质芯片(SELDI-TOF-MS)技术检测了常规体外培养的正常肾细胞株(HK-2)和肾癌细胞株(786-0)。两种细胞株均用IMAC3(固定金属亲和)和WCX2(弱阳离子交换)两种芯片检测。采用PBSIIC型蛋白质芯片阅读机读取数据，Ciphergen proteinchip3.1软件采集数据，Biomarker Wizard软件分析两种细胞株的蛋白差异。结果　SELDI-TOF-MS技术检测发现体外培养的肾癌细胞株与正常肾细胞株的蛋白质存在差异表达，共有15个蛋白质水平发生变化。IMAC3芯片发现差异峰6个，WCX2芯片发现差异峰9个。结论肾癌细胞株与正常肾细胞株之间的蛋白质谱表达有差异蛋白。 　　关键词　肾癌；发病机制；蛋白质组学；SELDI 　　 　　肾癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一，其发病率占全身恶性肿瘤的3％。全世界肾癌的发病率每年增加2％，每年死于肾癌者近100000例。在我国肾癌发病率仅次于膀胱癌居泌尿系肿瘤第二位，近年来有逐年上升的趋势，是威胁人民健康的最重要肿瘤之一，同时也是成人肾脏最常见的恶性实体瘤。约50％的患者首次就诊时已属晚期，约40％的患者术后转移或复发，转移性肾癌预后较差，平均存活时间小于1年，3年存活率低于5％。但就是这样一种对人类威胁如此之大的疾病，我们对其发病机制并不是非常清楚。目前国内外对肾癌发生机制的研究大都是在基因水平，但基因的功能活动要靠蛋白质来体现。由于存在转录后剪切和翻译后的修饰加工，使得基因组DNA或mRNA的水平并不完全代表蛋白质的水平，也就是说基因的种类和数目不等于mRNA的种类和数目，mRNA的种类和数目也不等于蛋白质的种类和数目。因此，要对生物功能的执行者一蛋白质进行研究，从蛋白质整体水平来探讨肿瘤组织或细胞蛋白质结构功能关系及蛋白质间的相互作用，阐明其癌变的本质。本文应用SELDI-TOF-MS技术对体外培养的正常肾细胞株和肾癌细胞株进行了蛋白质差异分析，建立了相应的蛋白质表达图谱，发现了一系列差异蛋白，从而为在蛋白质水平上研究肾癌的发病机制及新的治疗靶位的寻找奠定了一定的基础。 　　 　　1　材料和方法 　　 　　1．1 试剂及芯片　HPLC水，乙氰，尿素，Tris-cL，HEPES，CHAPS,TritonX-100，SPA，三氟乙酸均购自Sigma公司；蛋白质芯片(IMAC3，WCX2)购自Ciphergen公司；PRMI1640购自GIBCO公司；胎牛血清购自杭州四季青公司。 　　1．2细胞来源　肾癌786-0细胞株购自上海生命科学研究所；正常肾细胞株HK-2由青岛大学分子生物实验室提供。 　　1．3细胞的培养 　　1．3．1肾癌786-0细胞株的培养　在长满肾癌786-0细胞的培养瓶中加入0.25％的胰酶消化液，37℃CO2孵箱中孵育2分钟，倒掉消化液，加入含10％胎牛血清的PBMI1640培养液反复吹打，1:2传代。置于5％CO2，37℃的培养箱中常规培养。 　　1．3．2正常肾HK-2细胞株的培养　在长满肾HK-2细胞的培养瓶中加入0.25％的胰酶消化液，37℃CO2孵箱中孵育4分钟，倒掉消化液，加入含15％胎牛血清的PRMI1640培养液反复吹打，1:2传代。置于5％CO2，37℃的培养箱中常规培养。 　　1．4细胞蛋白质的制备　细胞传代第二天，细胞生长旺盛，约占培养瓶80％。应用无菌刮刀刮取细胞，用预冷的PBS洗3遍，细胞计数。加入裂解液(8MUrea，4％CHAPS，40mM Tris-HCLPH7.4)按200μl/5.0×106个细胞加入。4℃剧烈震荡30分，14000nmp离心30分。上清采用蛋白核酸分析仪测定蛋白浓度，加入裂解液调节至所有样品浓度为2mg/ml，上清分装-86℃冰箱保存备用。分别采用IMAC3和WCX2芯片检测，每个样品至少在两个以上的同种芯片上检测。以排除同一种芯片之间的组间差异。 　　1．5 IMAC3蛋白芯片的实验步骤　a．将芯片装入蛋白工作平台，每孔加入5μl100mM硫酸铜，温盒内孵育15分钟，不要使芯片在空气中干燥b．重复上述操作一次。c．用流动的去离子水清洗芯片10秒以移去过多的铜。d．用大量的50Mm,PH4.0的醋酸钠．清洗芯片。e．再用流动的去离子水清洗一次。f．每孔加入5μl缓冲液(PBS中含250mM氯化钠和0.1％Triton X-100)。震荡孵育5分钟。g．将蛋白芯片