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一起家庭内HIV-1感染分子流行病学研究 　　摘要：［目的］采用现场流行病学和分子流行病学相结合的方法，以阐明家庭内成员HIV-1病毒传播关系。［方法］通过定性流行病学，调查一家庭内各成员有关HIV-1感染及其相关因素，并应用巢式RT-PCR扩增HIV-1 pol区和env区基因，经DNA测序后用遗传进化系统树比对的方法，结合现场调查资料进行综合分析。［结果］该家庭中3人HIV感染毒株亚型均为CRF 07-BC。3个病例毒株的基因同源性高达99％和98％，且克隆基因差异较小，父母之间的基因克隆进化关系成立，但父子之间的进化关系明显大于母子的关系。3人与耐药相关基因突变位点分布情况基本一致，但在A71T位点上的突变率以儿子最高（100％），父亲其次（83％），母亲则未发生突变。［结论］该家庭中母亲是感染了父亲的部分尚未发生变异的病毒株，儿子则感染了父亲体内的变异株，初步提示为家庭内个人密切接触的HIV感染。 　　关键词： HIV-1；家庭内感染；流行病学中图分类号： R 512.91文献标识码：Ａ 　　 　　众所周知，HIV-1是通过性接触、血液（针刺吸毒或使用血液及血液制品）以及母婴途径传播。绝大多数研究发现，家庭内的密切接触与HIV-1病毒的感染无关［1~4］。但是有报道证明了一些特殊的情况也可造成HIV-1病毒的传播［5~8］，包括可能有家庭内的传播［9~13］。本次研究特别关注1例无性接触、明显的血液接触和母婴途径而感染HIV-1的病例，并运用分子流行病学的证据证明病毒是从家庭内1位成员传播而来。 　　 　　1材料与方法 　　 　　1.1流行病学调查 　　在知情同意的前提下，对一感染HIV-1的家庭中3位成员进行咨询访谈。调查内容主要包括调查对象的人口社会学特征、感染HIV的可能途径、发病的症状和治疗情况等。 　　1.2实验室检测 　　3位病人的血样在采集后24 h内送往本中心实验室，实验测定项目包括CD4细胞计数、HIV-1病毒载量检测、基因亚型分析和耐药突变测定。 　　1.2.1CD4?＋淋巴细胞计数流式细胞仪(美国BECTON DICKINSON公司)测定CD4、CD8、CD3 T淋巴细胞绝对值。将20 μL CD4/CD8/CD3 TRITEST试剂加入CD4绝对计数管中，加入50 μL 抗凝血，室温避光15 min，加入免洗溶血素450 μL ，室温避光15 min，用FACSMULTISET软件检测并进行自动分析。 　　1.2.2病毒载量测定采用核酸序列扩增实验（Easy Q NASBA）。严格按试剂说明书操作。 　　1.2.3基因亚型和耐药位点突变分析 　　① 血浆HIV-1 RNA 提取：使用离心柱吸附RNA分离方法（QIAamp? viral RNA mini kit，QIAGEN）提取RNA，-80℃冻存。 　　② HIV-1 RNA 逆转录巢式PCR（RT-PCR）：使用RNA逆转录和PCR一步法扩增试剂（Titan One Tube RT-PCR System, Roche Diagnostics GmbH，Germany）和PCR扩增试剂（Expand High Fidelityplus PCR System, Roche Diagnostics GmbH，Germany）。 　　③ RT-PCR逆转录扩增反应：pol区引物SHP1(5’-TGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC-3’, HIV-1 HBX2, 2027-2050)和SHP2(5’-CTGTATTTCTGCTATTAAGTCTTTTGATGGG -3’ , HIV-1 HBX2, 3509-3539),env区引物ED5和ED12［14］，各0.5 μL (20 mmol/L), MgCl?2 1.5 μL(25 mmol/L), 5x缓冲液 5 μL, dNTP混合液0.5 μL(10 mmol/L), DTT ?1.25 μL，RNA酶抑制剂 0.25 μL，酶混合物 0.5 μL?(5 U/μL), DEPC水12 μL, RNA模板3 μL，反应终体积为25 μL。反应条件为：48℃ 45 min,94℃ 2 min；?94℃ 30 s,55℃ 30 s,68℃ 2.5 min,35个循环；68℃ 延伸?10 min，4℃保温(热循环仪, GeneAmp?PCR System 9700, Applied Biosystems)。 　　④ 第二轮PCR扩增： pol区引物SHP3（5’-CAGAGCCAACAGCCCCACCA-3’，HIV-1 HBX2, 2147-2166）和SHP4 (5’-CTTCTGTATATCATTGACAGTCCAGCT-3’，HIV-1 HBX2,