二次外周血干细胞移植改善兔肢体缺血实验研究.docVIP

二次外周血干细胞移植改善兔肢体缺血实验研究 　　[摘要] 目的 建立兔肢体缺血模型，观察二次外周血干细胞移植对肢体缺血的治疗效果。 方法 连续4 d皮下注射7.5 μg/kg G-CSF进行干细胞动员，分离外周血单个核细胞制成干细胞悬液。制备兔肢体缺血模型，将干细胞悬液分10～12个点注射于手术切口两侧肌肉，实验组动物于移植后第18天重复进行干细胞动员并在第22天进行第二次干细胞移植。 结果 术后多普勒超声显示手术肢体的血液供应阻断，模型制备成功。1周后检测侧支循环开始建立，实验6周后，二次移植兔缺血部位肌肉毛细血管密度平均为26.1个，单次移植兔为20.9个，差异有统计学意义（P 　　[关键词] 缺血模型；外周血干细胞；二次移植 　　[中图分类号] R332[文献标识码] A[文章编号] 1673-7210（2012）04（b）-0035-03 　　骨髓干细胞移植治疗肢体缺血安全、有效[1]。但由于采髓量大，对患者的全身情况要求高，若进行第二次采髓增加干细胞移植次数相对困难。随着干细胞研究技术的深入发展以及自体外周血干细胞移植治疗肢体缺血技术的出现，采集第二次外周血干细胞对肢体缺血的治疗成为可能。本研究通过手术切除兔下肢动脉血管建立肢体缺血模型，并以自体外周血干细胞移植一次为对照，旨在通过增加外周血干细胞移植次数研究对肢体缺血的改善作用。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验动物 　　新西兰白兔27只，体重2.6～3.4 kg，平均3.1 kg，雌雄不限，由徐州医学院动物实验中心提供。设实验组（二次移植）14只，对照组（一次移植）13只。 　　1.2 主要材料 　　粒细胞集落刺激因子（G-CSF，厦门特宝公司），兔淋巴细胞分离液（密度1.096 5 g/mL，天津灏阳公司）。 　　1.3 第一次干细胞动员 　　所有动物术前连续4 d以7.5 μg/kg经皮下注射G-CSF进行干细胞动员。注射前及注射过程中经耳缘静脉采血计数白细胞。 　　1.4 模型制作方法[2] 　　术前12 h禁食禁水，手术时以10 g/dL水合氯醛1.8 mL/kg沿耳缘静脉缓慢推入，待角膜反射迟钝后仰卧固定，右下肢常规备皮消毒，铺无菌洞襟，沿股动脉走向切开皮肤，暴露股三角区，从腹股沟韧带至膝关节，钝性分离血管鞘，将所有动脉分支包括股深动脉、旋股外侧动脉、阴部动脉、?动脉及股浅动脉等结扎并离断剔除股动脉，分层缝合肌肉及皮肤。手术过程严格无菌操作，术后连续3 d健肢肌注青霉素20万U/（kg?d），预防伤口感染。 　　1.5 干细胞移植 　　肝素润湿20 mL注射器及头皮针，手术麻醉前经耳静脉采集20 mL外周血，肝素抗凝。与模型制备同时进行单个核细胞的分离，生理盐水1∶1稀释，置于兔淋巴细胞分离液上，2 000 r/min离心20 min，分离单个核细胞，生理盐水洗涤3次。调整细胞密度1×107/mL，肌肉层缝合后沿手术切口走向两侧内收肌群及腓肠肌用1 mL皮试针分10～12点注射。 　　1.6 第二次干细胞动员与干细胞移植 　　实验组动物于术后第18天开始重复“1.3”项下实验步骤进行第二次干细胞动员，动员结束后第二天重复“1.5”项下实验步骤进行第二次外周血干细胞移植。 　　1.7 观测指标 　　1.7.1 动态观察观察动物活动情况，肢体颜色、温度变化（红外体温检测仪，DT-880B型，深圳华盛昌公司）及肌肉萎缩情况。 　　1.7.2 皮肤微循环灌注测定10 MHz多普勒超声仪分别于术后l d、1周及6周于缺血股内侧正中部位行彩色多普勒血流灌注显像和频谱多普勒检测。 　　1.7.3 免疫组化检测毛细血管密度第一次干细胞移植术6周（实验组动物第二次移植术后3周）后，经耳缘静脉注射20 mL空气处死大白兔，取股骨中段和胫骨背侧的肌肉3～5块，10%甲醛溶液固定24 h，常规脱水、透明、石蜡包埋，做成10 μm厚的切片，免疫组化染色，在光学显微镜下，每张切片随机计数5个高倍视野内的棕黄色染色管状数，取其平均数，计数新生毛细血管数。 　　1.8 统计学方法 　　采用统计软件SPSS 15.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P 0.05）。 　　干细胞移植技术治疗糖尿病足、下肢动脉硬化性闭塞症等下肢严重缺血性疾病，可增加下肢血供，升高皮温，缓解疼痛，溃疡愈合，改善间歇性跛行，使部分患者避免截肢或降低截肢平面。但单次移植往往不能满足患者需求，因此有患者愿意行第二次移植[9]。而采集动员后的外周血干细胞总量明显多于骨髓干细胞，因此外周血干细胞成为二次移植的首选干细胞来源。本研究表明兔缺血肢体二次移植组的新生毛细血管数