沉淀反应及等电点测定.PPT

实验四 蛋白质呈色反应、沉淀反应及等电点测定 * 实验四 蛋白质呈色反应、沉淀反应等电点测定 实验四 蛋白质呈色反应、沉淀反应及等电点测定 * 2013-1 一、实验目的 通过颜色反应掌握鉴别蛋白质的方法 掌握沉淀蛋白质的原理及方法 熟悉等电点测定的原理 实验四 蛋白质呈色反应、沉淀反应及等电点测定 * 2013-1 二、实验原理及操作 如何鉴别蛋白质？ 通过呈色反应 蛋白质有哪些呈色反应？ （1）缩二脲反应（紫红色反应） （2）茚三酮反应（紫色反应） （3）酚试剂反应（蓝色反应） （一）蛋白质的呈色反应 实验四 蛋白质呈色反应、沉淀反应及等电点测定 * 2013-1 二、实验原理及操作 蛋白质（-CO-NH-） CuSO4 -OH- 紫红色化合物 茚三酮反应： 蛋白质（自由氨基） 紫色化合物 茚三酮 酚试剂反应（Folin-Denis）： 缩二脲反应： 酚类化合物在碱性条件下还原酚试剂，生成蓝色钼蓝 蛋白质 （酪氨酸等） 酚试剂 蓝色化合物 -OH- 实验四 蛋白质呈色反应、沉淀反应及等电点测定 * 2013-1 二、实验原理及操作 1.双缩脲反应 （1）1：10鸡蛋白溶液 2d （2）10%NaOH溶液 5d （3）1%CuSO4溶液 1d （4）混匀，观察颜色变化 注意：10%NaOH和0.5%NaOH不要混淆使用 2.茚三酮反应 （1）1：10鸡蛋白溶液 4d （2）蒸馏水 10d （3）0.1%茚三酮溶液 8d （4）混匀，沸水浴1分钟 （5）冷却后观察颜色变化 实验四 蛋白质呈色反应、沉淀反应及等电点测定 * 2013-1 二、实验原理及操作 3. Folin-Denis反应 试管 1 2 3 4 1: 10鸡蛋白2d 0.25%白明胶2d 0.25%酚溶液2d 0.25%酪氨酸2d 10%NaOH 3d 3d 3d 3d 蒸馏水 6d 6d 6d 6d 酚试剂 1d 1d 1d 1d 颜色变化 ？ ？ ？ ？ 注意：酚试剂与0.25%酚溶液、酪氨酸与酪蛋白不要混淆使用 实验四 蛋白质呈色反应、沉淀反应及等电点测定 * 2013-1 二、实验原理及操作 蛋白质溶液的稳定因素：电荷 + 水化膜 （二）蛋白质的沉淀反应 被破坏 蛋白质沉淀 实验四 蛋白质呈色反应、沉淀反应及等电点测定 * 2013-1 二、实验原理及操作 （二）蛋白质的沉淀反应 沉淀蛋白质的方法： （1）盐析（非变性，可逆） （2）重金属盐沉淀（变性，不可逆） （3）生物碱试剂沉淀（变性，不可逆） （4）有机溶剂 实验四 蛋白质呈色反应、沉淀反应及等电点测定 * 2013-1 二、实验原理及操作 1.盐析 蛋白质 + 中性盐（硫酸铵） 蛋白质沉淀析出 1ml血清 1ml饱和硫酸铵 混匀，静置20’, 球蛋白析出 4000rpm，8’ 收集上清 （清蛋白） 固体硫酸铵 边加边摇 至溶液浑浊 加水2ml 观察结果？ 考虑：分段盐析？ ? 实验四 蛋白质呈色反应、沉淀反应及等电点测定 * 2013-1 二、实验原理及操作 2.重金属盐沉淀蛋白质 实验四 蛋白质呈色反应、沉淀反应及等电点测定 * 2013-1 二、实验原理及操作 3.生物碱试剂沉淀蛋白质 实验四 蛋白质呈色反应、沉淀反应及等电点测定 * 2013-1 二、实验原理及操作 （三）蛋白质等电点的测定 P NH3+ COOH P NH2 COO- P NH3+ COO- pH ＜pI pH ＞pI H+ H+ OH- OH- pH = pI 不易沉淀 易沉淀 不易沉淀 等电点：蛋白质所带正负电荷相等时溶液的pH值 （即蛋白质处于pH=pI时，沉淀最多） 实验四 蛋白质呈色反应、沉淀反应及等电点测定 * 2013-1 二、实验原理及操作 1 2 3 4 5 蒸馏水ml 8.4ml 8.7ml 8.0ml 8.2ml 7.4ml 0.01mol/L醋酸 0.6ml - - - - 0.1mol/L醋酸 - 0.3ml 1.0ml - - 1.0mol/L醋酸 - - - 0.8ml 1.6ml 酪蛋白醋酸钠溶液 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 相当的pH 5.9 5.3 4.7 4.0 3.5 浑浊度 ？ ？ ？ ？ ？ 用“+”表示浑浊度，并指出酪蛋白的等电点是多少？ 注意：可用同一支刻度吸管从稀到浓量取醋酸，量取一定要准确 实验四 蛋白质呈色反应、沉淀反应及等电点测定 * 2013-1 三、实验结果、现象 四