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泥螺多肽酶解工艺研究 　　【中图分类号】 R285.5 【文献标识码】A【文章编号】1672－3783(2011)04－0337－01 　　 　　【摘要】 本文采用胰蛋白酶水解海洋生物泥螺的软体组织，进行多肽的制备工艺分析研究，以期获得较纯的多肽。本文以泥螺多肽酶解度为指标，通过L16（45）正交实验和酶解条件优化实验确定多肽的最佳酶解工艺。结果表明：胰蛋白酶酶解泥螺蛋白制备多肽的最佳酶解条件为：温度45℃、料液比1:4、pH 8.7、酶解时间8h、加酶量0.48%。 　　【关键词】 泥螺多肽；胰蛋白酶；酶解工艺 　　 　　 抗菌活性肽是生物界中广泛存在的一类生物活性小肽［1-3］，是生物体固有免疫的关键因子之一。泥螺(Bullacta exarata)，俗称吐铁、黄泥螺、梅螺等［4］，隶属于腹足类后鳃亚纲软体动物，由贝壳和软体两部分组成，为西太平洋沿岸半咸水滩涂的习见种类，广泛分布于我国南北沿海潮间带滩涂，是典型潮间带底栖匍匐动物，多栖息在中底潮带，泥沙或沙泥的滩涂上，在风浪小、潮流缓慢的海湾中尤其密集，以东海和黄海产量最多。 　　海洋生物多肽是目前海洋生物活性物质研究的一个重要领域。舟山群岛素以渔盐之利、舟楫之便而扬名于世。泥螺遍布于舟山各港湾海涂，尤其以普陀朱家尖、定海长白泥螺为最，年产量在1.5万吨左右。目前采用胰蛋白酶从泥螺中提取多肽在国内外尚未见报道。本文首次就胰蛋白酶酶解泥螺制备多肽，并对其工艺条件进行了研究，以期获得可行性的泥螺多肽研究制备工艺方法,为今后酶解法对软体动物多肽的深入研究和开发利用提供科学依据，并极可能为水产养殖业的病害防治，食品加工中防腐剂的研究，畜禽业饲料添加剂研究等领域提供科学的借鉴具有重要意义。? 　　1 仪器与材料 　　1.1 材料：泥螺采集自舟山马目泥螺养殖场；超滤膜为上海摩速科学器材有限公司产品，福林酚试剂为上海如吉生物发展有限公司产品，胰蛋白酶等试剂均为国药集团化学试剂有限公司分析纯。 　　 1.2 主要仪器与设备 ：高速组织捣碎机（DS-1上海标本模型厂）；电子分析天平（BS110 北京赛多利斯天平有限公司）；精密pH计（PHS-250 上海精密科学仪器有限公司）；恒温水浴锅（SSW-420-2S 上海一恒科学仪器有限公司）；冷冻干燥机（LGJ-18 北京松源华兴科技发展有限公司）；高速冷冻离心机 （CF16RXⅡ 日本日立）；紫外可见分光光度计（752FC上海光谱仪器有限公司）；旋转蒸发仪（RE-2000A 上海亚荣生化仪器厂）。? 　　2 实验方法 　　2.1.1 酪氨酸标准曲线：酪氨酸标准曲线的绘制:精确称取烘干至恒重的酪氨酸0.1000g，逐步加入6 mL 1mol.L-1的HC1溶解，用0.2mol的HCl定容至100mL，其浓度为1000?g.mL-1，再吸取此液lOmL，以0.2mol的HCl定容至100mL，即配成100?g.mL-1的酪氨酸溶液。将此酪氨酸溶液稀释成0～60?g.mL-1的不同梯度的浓度，取7支试管编号，分别吸取不同浓度的酪氨酸lmL，各加入0.4mol的Na2CO35mL，再分别加入稀福林试剂lmL。摇匀置于水浴锅中40℃保温发色20min，用分光光度计在680nm处比色测定光密度OD值［5］。? 　　 　　2.1.2 多肽标准曲线：取0.8mL蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准（20mg胎牛血清，简称BSA）中，充分溶解后配制成25mg.mL-1的蛋白标准溶液。取适量25mg.mL-1蛋白标准，用生理盐水稀释至终浓度为0.5mg.mL-1。根据样品数量，按50体积BSA试剂A加1体积BSA试剂B（50:1）配制适量BSA工作液，充分混匀。BSA工作液室温24小时内稳定；将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20?L加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20?L；加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20?L；各孔加入200?LBSA工作液，37℃放置20～30分钟；测定A562。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。 　　2.2泥螺多肽最佳酶解工艺的研究： 泥螺组织捣碎匀浆，用缓冲液调pH,加入胰蛋白酶酶解数小时，100℃下灭酶1min；离心机8000r/min, 4℃下离心20min；取上清液定容，采用电位滴定法测定氨基态氮(AAN)含量。? 　　 　　以酶解液中的ANN含量为指标，选择A(温度)、B(pH)、C(料水比)、D(加酶量)、E(酶解时间)五个因素，每个因素选四个水平进行五因素四水平的正交实验见表2，比较各因素各水平下胰酶对泥螺酶解的效果，以最终确定胰酶酶解的最佳条件。 　　2.3 AAN含量测定： 于250mL烧杯中加入酶解上清液5.0mL，加蒸馏水定容至50.0mL，