研究软腐病病原菌终极腐霉的致病机理.docVIP

研究软腐病病原菌终极腐霉的致病机理 　　石斛属（Dendrobium spp.）是兰科植物的第二大属，目前该属在全世界共发现 1100 多种，在我国有 76 个种和 2 个变种。其中，石斛属药用植物金钗石斛（D. nobile Lindl）是传统名贵中药，被我国历版药典所收录，以其干燥或新鲜的茎入药，具有滋阴清热、益胃生津之功效。由于近年来石斛属药用植物被过度挖掘，野生资源濒临枯竭，石斛属药用植物已被国家列为一级保护植物名录。 　　 　　随着人们对石斛中药材需求量的逐渐增加，目前药用石斛属植物人工栽培的面积不断扩大。然而，随之而来的各种病害不断出现，严重阻碍了人工栽培的进一步发展，并给种植户带来了巨大的经济损失。有研究表明，钟器腐霉曾在云南省导致大规模鼓槌石斛、球花石斛、线叶石斛茎部的腐烂。在以往的研究中，我们鉴定出金钗石斛软腐病的病原真菌为终极腐霉。 　　 　　为深入研究软腐病病原菌终极腐霉的致病机理，探讨其在导致金钗石斛软腐病病害过程中的机制，金钗石斛的根、茎和叶等部位发生的显微、超微结构变化以及病原菌在植物体内的分布和侵染情况，本研究采用水压片法以及扫描电镜观察法分别对接种终极腐霉病原菌前后金钗石斛苗的根、茎和叶的结构变化进行观察，为深入理解病原菌的侵染过程，揭示其形态学特征和侵染机制，以及为更好预防和控制此病害的发生发展提供重要的理论依据。 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1.1 材料 　　 　　1.1.1 植物材料 　　 　　金钗石斛组培苗为本实验室保存。 　　 　　1.1.2 主要仪器 　　 　　ZEISS Axio Imager A1 型光学显微镜购自德国蔡司公司；JSM-6510 LV 型扫描电子显微镜购自日本电子株式会社。 　　 　　1.2 方法 　　 　　1.2.1 病原菌 　　 　　终极腐霉对金钗石斛的致病性试验 将刚出瓶的生长一致的株高 4 ~ 6 cm 的新鲜金钗石斛组培苗预先栽种在装有灭菌的栗树皮基质的塑料花盆内，每个花盆栽种 3 株组培苗。病原菌为金钗石斛发病植株上分离得到的终极腐霉。 　　 　　采用孢子喷洒叶片的方法进行致病性试验，接种的病原菌为孢子悬浮液（1 × 106个/ml），均匀地喷洒于金钗石斛幼苗的叶片上。对照组喷洒无菌水。 　　 　　致病组和对照组均设 30 个重复。接种后置于 20 ~25 温室塑料膜保湿培养 48 h，然后揭去塑料膜，每天观察植株发病情况。 　　 　　1.2.2 常规水压片法进行光镜观察 　　 　　取 1 滴10% KOH 溶液滴加到载玻片上，然后取健康的和发病 48 h 的金钗石斛的叶片作为观察对象，徒手切片法切取尽量薄的叶片组织，浸入 KOH 溶液中装片，光学显微镜下观察、照相。 　　 　　1.2.3 扫描电镜样品的制备流程 　　 　　取健康的以及发病 48 h 的金钗石斛的根、茎、叶等部位，用于制作扫描电镜样品，样品的处理按文献[8]进行： 　　 　　2.5% 戊二醛室温下固定 4 ~ 6 h 后，以 PBS（pH6.8，0.1 mol/L）洗涤 3 次，每次 30 min；分别经30%、50%、70%、80%、90% 以及 100% 丙酮梯度脱水，每个梯度 3 次，每次 30 min；再经纯醋酸异戊酯置换 3 次，每次 30 min；经 CO2临界点干燥、粘样，再经过金离子喷溅，最后于扫描电子显微镜下观察、拍照。 　　 　　2 结果 　　 　　2.1 光学显微镜观察 　　 　　致病前后金钗石斛叶片显微结构的变化在光学显微镜下，正常的叶肉细胞细胞壁较厚，排列规则，叶绿体分布于细胞的周边（图 1A），而发病的叶肉细胞壁变薄，细胞完整性受到破坏，叶绿体分散、零乱（图 1B，C）。终极腐霉病原菌在金钗石斛叶片内大量存在，菌丝生长旺盛，直径可达 11 μm，菌丝体内充满泡囊（图 1C 黑色箭头所示），且具有流动性，这与终极腐霉有关的形态描述相一致。大量的卵孢子和孢子囊分布在叶肉细胞间或内部，卵孢子壁厚 2 ~ 3 μm（图 1B）。 　　 　　2.2 扫描电子显微镜观察 　　 　　致病前后金钗石斛根、茎、叶结构变化。 　　 　　2.2.1 金钗石斛植株被病原菌侵染前后的根表面和横切面显微结构 由图 2 可以看出，未被病原菌侵染的金钗石斛植株根的表面结构保持完整（图2A），根被细胞显示出典型的网状纤维样结构，皮层细胞结构较完整，其体积明显比根被细胞大，有较多颗粒样物质（图 2B 上箭头），推测为淀粉粒样的结构，根的中柱髓部（图 2B 下箭头）结构也较完整，细胞排列规则。被病原菌侵染的金钗石斛植株根的表面分布有大量的病原菌终极腐霉的菌丝（图 2C 箭头），病原菌菌丝体穿过根被死亡细胞表面的各种孔洞，在根部蔓延和穿行，交织成网状，进而深入根皮层细胞，破坏皮层细胞的细