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蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测 摘要 随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究其他研究，越来越需要纯度高的酶制剂，这就要求我们熟悉酶提纯的一般操作及酶的提纯及活力测定等重要的生物实验技术本次实验主要提取啤酒酵母中的蔗糖酶。在验过程中用乙醇分级法，DEAE-Cellulose柱层析，层析提取纯化蔗糖酶。在实验过程中，虽然我们很努力,但由于我们对实验的程序不熟悉，因此在实验的一些过程中有一些明显的操作失误，使得实验的最后测定结果与理论值有一定出入。DEAE-Cellulose柱层析生物体内所发生的一切化学反应，几乎都是在专一性酶的催化下进行的，因此酶的研究对了解生命活动的规律以及生命本质的阐述具有十分重要的意义。随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究以及，纯度高的酶制剂。由于酶本身也是蛋白质，因此酶分离提存的方法大体上与蛋白质纯化方法相同，一般来说，没有一种固定的方法，而往往根据所要分离提纯酶的取材以及酶本身的物理﹑化学及生物学性质来确定分离提纯方法。各种酶的纯化通常有五个阶段：①材料的选择与预处理；②细胞破碎；③抽提；④纯化；⑤浓缩﹑干燥及保存。酶分离纯化成功与否的重要标志一是要有较高的收率二是达到所要求的纯度，这两个指标通常是矛盾的，可根据需要来有所侧重，一般来说，好的方法与步骤应该是简单易行，最终的酶制剂有较高的收率和纯度。在分离提纯过程中，应该尽量避免引起蛋白质变性的各种因素，此外，在分离提纯前，必须建立对酶的分析鉴定方法，以正确指导分离提纯地进行。.1葡萄糖浓度标准曲线的制作：取支编号的试管按下表的顺序加入0.2%Glc，水及3,5-二硝基水杨酸试剂。然后在沸水浴中加热5分钟，然后立即用自来水冷却并用蒸馏水定容至25ml，摇匀，于540nm测光密度，结果如下表所示：ug）BG溶液 0.2%Glc标准液（ml）） 平均OD540nm 1 0.0 0.0 2.0 1.5 0.0 0.0 0.0 2 0.4 0.2 1.8 1.5 0.065 0.073 0.069 3 0.8 0.4 1.6 1.5 0.153 0.167 0.160 4 1.2 0.6 1.4 1.5 0.257 0.185 0.221 5 1.6 0.8 1.2 1.5 0.346 0.334 0.340 6 2.0 1.0 1.0 1.5 0.443 0.429 0.436 7 2.4 1.2 0.8 1.5 0.508 0.506 0.507 8 2.8 1.4 0.6 1.5 0.594 0.602 0.598 9 3.2 1.6 0.4 1.5 0.669 0.658 0.664 10 3.6 1.8 0.2 1.5 0.766 0.753 0.760 11 4.0 2.0 0.0 1.5 0.850 0.818 0.834 2.2标准蛋白曲线的制作取11支编号的试管，分别准确加入如下表所示的牛血清白蛋白溶液，然后分别加入1.5ml考马斯亮蓝G-250蛋白染色试剂，摇匀，放置3min后，在5nm比色读取OD值，结果如下表所示：ug/ml））.3转化酶的纯化.3.1粗品的制备和乙醇分级沉淀.3.1.1自溶用台秤称取40g的新鲜啤酒酵母放在250毫升三角瓶中，再分别放入1.2克乙酸钠细粉末、20毫升甲苯。然后在35℃水浴中间隔片刻震荡、保温30分钟，此时会观察到菌体自溶现象。.3.3.2抽提及粗酶的制备往上述自溶液中加入60毫升水，于35℃保温过夜。第二天，将自溶液于4000RPM*15min离心。取出离心管后分三层：下层透明，中间为蛋白层，上层为有机层。用吸液管将最上层的甲苯吸去，然后可再用一药勺挡住块状粘稠物，倾斜离心管倒出上清液。弃去粘稠物。此时会有一些悬浮物存在。再离心一次（4000RPM*20min），如上清液已滤清，小心倒入250毫升烧杯中。得到的溶液就是无细胞抽提液即粗酶液。量出粗酶液的体积VE1=42ml，从中取出1毫升置0—4℃保存，将待测酶活力和蛋白浓度2.3.3.3乙醇分级沉淀先用10%的乙酸调粗酶液pH在4.4—4.6之间，记录加入10%乙酸的体积。⑴ 32%乙醇饱和度按下列的公式算出使粗酶液的乙醇浓度达到32%时所需乙醇体积。X1/V+X1=0.32 其中V=44ml，需要加入95%的乙醇体积：X/0.95=22ml注意：在滴加乙醇时滴与滴之间不能连成线 。 滴加结束后，于4000RPM*5min。上清转移到另一烧杯中待用，弃去沉淀。⑵47.5%的乙醇饱和度按下式算出使酶液乙醇浓度达到47.5%时所需乙醇的量。X2/V=X2=0.475需要加入95%的乙醇体积X2/0.95=44ml按下式