辣根过氧化物酶在一种新型有机介质中的催化反应_蒋太交.docVIP

辣根过氧化物酶在一种新型有机介质中的催化反应_蒋太交 第30卷　第6期 1998年11月 Vol.30,No.6 ACTABIOCHIMICAetBIOPHYSICASINICA Nov.,1998 研究简报 辣根过氧化物酶在一种新型有机介质中的催化反应 蒋太交　吉鑫松　袁中一* (中国科学院上海生物化学研究所,上海200031) 摘要　　选择合适的酶反应介质体系,是酶应用于有机合成的一个重要环节。利用适宜分子量的聚乙二醇(PEG)可以将辣根过氧化物酶(HRP)分散在甲苯中,摸索了HRP在聚乙二醇(PEG)-甲苯互溶体系反应的适宜条件,即PEG/甲苯的比例、含水量、pH值、底物浓度等对酶活性影响,结果发现PEG含量越低,含水量越高,酶的活力越高;酶在此体系中的最适pH值为7.0,最适过氧化氢浓度为20mmol/L,愈创木酚的浓度为0.1mol/L。在含水量、PEG含量相同条件下,对比研究了以乙醇、二氧六环、甲苯为主体反应介质体系中HRP的活力,结果发现乙醇-PEG、二氧六环-PEG中测不出酶活力,观察到酶明显失活。而在甲苯-PEG的反应介质体系中,酶呈现很高活力且比HRP在甲苯中的活力提高了10倍左右。 关键词　　反应介质;聚乙二醇(PEG);辣根过氧化物酶(HRP) 酶在有机溶剂中易于失活和变性使其在工业上的应用大受限制[1,2]。为此,科学家们尝试了许多方法。除了对酶本身进行化学修饰和经过特殊处理制备酶与表面活性剂[4,5]或高聚物[6]的复合物以外,选择和优化酶的反应介质是另一个十分重要的途径。研究表明酶在有机相中的催化作用与反应介质有着密切联系。亲水性较强的有机溶剂对酶结构破坏大。处于疏水性较强的有机溶剂中,酶则很难溶解,内部传质受到限制。而反相胶束体系中的表面活性剂毒性大而且难以除去。为此,我们设计了一个聚乙二醇(PEG)-甲苯互溶体系,并验证了甲苯-PEG体系中各种因素对辣根过氧化物酶反应的影响。1.1　反应介质体系的组成及酶活测定 PEG1000纯化参照文献[10]的方法,先将30gPEG溶解在40的240ml丙酮中,然后容器浸入冰浴使PEG沉淀下来。再往其中加240ml乙醚并用砂芯漏斗过滤去溶液,收集的沉淀用240～300ml乙醚洗,最后真空抽干和贮藏在干燥器中。制备PEG-甲苯体系时,取一定量的PEG溶解在甲苯中,配成每毫升甲苯中含有1g纯化干燥的PEG。根据需要,再将该溶液用甲苯稀释成不同PEG含收稿日期:1998—03—12　　接受日期:1998—05—25 *联系人:Fax,021e-mail,zhongyi@ [9] [4] [1,7,8] [3] 酶活测定在25进行,所用底物H2O2和愈创木酚都以PEG-甲苯为溶剂配制。先把5～10μl20g/LHRP溶液加入甲苯-PEG体系中,摇匀。然后加愈创木酚,最后加H2O2引发反应。酶的活力以相对值表示。 1.2　几种PEG对反应体系形成的影响 在25下,分别将一定量的PEG加入到甲苯中,发现PEG600、PEG1000和PEG2000可以与甲苯形成均一的体系,而分子量3000或以上的PEG在常温下很难溶解于甲苯中。酶溶液不能够均匀分散在PEG2000与甲苯体系中。而在同样条件下,酶在PEG600与甲苯体系中的活性很低。只有在PEG1000与甲苯体系中,酶能够充分分散且具有良好的反应特性。因此,下面的研究都是以PEG1000为材料的。1.3　底物浓度的影响 在PEG-甲苯体系中研究了辣根过氧化物酶的活力与底物的关系。图1表示辣根过氧化物酶活力与愈创木酚、过氧化氢浓度之间的关系。在过氧化氢为20mmol/L时,随着愈创木酚浓度增加,酶活力也趋增大。当愈创木酚浓度超过0.1mol/L时,酶活力随愈创木酚浓度增加而增大的趋势有所下降,结果见图1。图1也表示了在愈创木酚浓度为0.1mol/L时,酶活力与过氧化氢浓度的关系。酶 度大于20mmol/L后,酶活力随过氧化氢浓度的增加而下降。这表明酶活力受到高浓度过氧化氢的抑制。本文发现过氧化氢的浓度为20mmol/L时,酶在PEG-甲苯体系中的活力最高 。 Fig.3　EffectofwateramountofPEG/toluenesystemon theactivityofHRP 从图可知pH值对酶活力的影响呈钟罩型曲线。酶的最适pH是7.0,与水溶液中的最适pH相同 。 Fig.1　DependenceofHRPactivityontheconcentrationof guaiacolandH2O2 1.4　聚乙二醇的影响 图2表示辣根过氧化物酶的活力与PEG含量之间的关系,在甲苯-PEG均一反应体系中,随着PEG含量的降低而酶活力上升,但PEG含量低于0.1g/ml时,反应介质很难形