Fc嵌合体结合唾液酸多糖实验 实验示意图.pptVIP

抗人IgG 抗体共轭碱性磷酸酶酶(AP酶)： /shqf-Products-7101972/； Goat Anti-Human IgG - AP：/order/catalog/product/628422?ICID=search-product 1ml ￥1700； 荧光素二磷酸(FDP)： /seardis.asp?id=2171353 5mg ￥1258； GlycoWell plates： Anti-IgG1-APC, human： /seardis.asp?id=2300736 1载体的构建 1.1 目的片段及点突变基因片段的扩增 1.1.1 设计相关引物（包括限制性内切酶位点），从克隆载体上扩增目的基因Siglec的保外段区域，并连接到T载体上（Siglec Ex-T vector）； 1.1.2 测序比对； 1.1.3 根据TakaRa点突变试剂盒设计相关引物，用Siglec Ex-T载体扩增获得点突变基因片段，并测序比对； 1.2 表达载体的构建 1.2.1 Siglec Ex-T和表达载体（pCDNA3.1-hIgG1 FC）用相应的限制性内切酶酶切后，电泳并切胶回收片段； 1.2.2 酶切Siglec Ex片段与pCDNA3.1-hIgG1 FC片段T4连接酶连接，转化感受态细胞，获得克隆菌株，并PCR检测； 1.2.3 菌种保存与质粒抽提； 2 细胞转染及Fc融合蛋白的表达 2.1 细胞培养 2.1.1 购买或要相应的细胞（COS-7，RAW264.7，CHO） 2.1.2 细胞冻存（购买的细胞和转染后的细胞可能要给钱找公司代液氮保存） 2.1.2 根据相应的细胞培养条件培养细胞，获得正常生长的细胞； 2.2 细胞转染 2.2.1 根据细胞转染试剂盒的操作步骤对细胞进行转染； （Lipofectamine® 2000） 2.2.2 对转染的细胞进行培养并通过抗性筛选获得稳定表达的细胞株； 2.2.3 对稳定表达的细胞株进行检测，包括western blot检测，基因组PCR检测； 2.3 表达Fc融合蛋白 2.3.1 将稳定表达的真核细胞扩大培养，收集细胞培养液，通过琼脂糖蛋白A过柱纯化，获得纯化的Siglec-Fc融合蛋白 2.3.2 对纯化的融合蛋白进行western blot检测； 3 唾液酸结合实验 唾液酸多糖 Neu5Acα2–6Galβ1–4Glc Neu5Acα2–3Galβ1–4Glc Siglec胞外段 人IgG Fc段 抗人IgG 抗体共轭碱性磷酸酶酶(AP酶) 荧光素二磷酸(FDP) Siglec-Fc 融合蛋白 GlycoWell plates 抗人IgG抗体共轭碱性磷酸酶(AP酶)：抗人IgG抗体特异性识别Siglec-Fc嵌合体Fc段，而AP酶与荧光素二磷酸(FDP)反应，降解FDP； GlycoWell plates：能够与唾液酸多糖共价结合的酶标板； 参考文献： [1] Bax M, Kuijf ML, Heikema AP, van Rijs W, Bruijns SC, García-Vallejo JJ, Crocker PR, Jacobs BC, van Vliet SJ, van Kooyk Y. (2011) Campylobacter jejuni lipooligosaccha-rides modulate dendritic cell-mediated T cell polarization in a sialic acid linkage-dependent manner. Infect Immun. 79(7):2681-9. IF: 4.0 [2] Lehmann F, Gäthje H, Kelm S, Dietz F. (2004) Evolution of sialic acid-binding proteins: molecular cloning and expression of fish siglec-4. Glycobiology. 14(11):959-68. IF: 3.7 [3] ——文献由杜娟娟师妹整理提供 Siglec胞外段 人IgG Fc段 Siglec-Fc 融合蛋白 Protein A 普通酶标板 生物素标记的唾液酸多糖(PAA-Bio) Neu5Acα2–6Galβ1–4Glc-Bio Neu5Acα2–3Galβ1–4Glc-Bio 链霉亲和素共轭碱性磷酸酶酶(AP酶) 荧光素二磷酸(FDP) 链霉亲和素共轭碱性磷酸酶(AP酶)：链霉亲和素特异性识别生物素，而AP酶与荧光素二磷酸(FDP)反应，降解FDP； 生物素标记唾液酸多糖：生物素标记多糖，使链霉亲和素能够识别； Pr