[研究生入学考试]酶学及酶工程课3章3节.pptVIP

酶学及酶工程 Enzymology and Enzyme Engineering 第三章 酶的结构与功能 第二节 酶的溶液构象测定（续） 2. 荧光光谱 荧光：某些带荧光基团的物质吸收特定波长激发光（excitation）能量，由基态跃迁到激发态。经内转换耗损部分能量后，再回到低能级，放出波长较大的光，称为荧光（emission）。产生荧光过程很快，约为10－8秒。停止激发光后荧光随之消失。激发光和荧光都有特定波长，激发光相对效率和荧光强度形成激发光谱和发射光谱。 荧光分析法 对荧光光谱及其变化进行分析，可以用于活性测定，构象变化测定，简单结构测定，微环境测定，必需基团测定等。 荧光分析法的优点：灵敏度高，选择性强，样品量少，方法简单。 使用范围：有产生荧光的基团参与，一般是芳环，特别是稠芳环的基团。 荧光强度公式 荧光强度 F＝KφI0（1－e－A） K：仪器常数，φ：量子产率，I0：激发光强度，A：样品吸光度 A较小时，可以近似为F＝KφI0A。 A大到一定值时，F会随A增加而减少，产生浓度淬灭现象。 量子产率φ：表示物质发射荧光的本领，定义为发射量子数与吸收量子数之比。 一般用荧光强度相对值：F1/F2＝φ1A1/φ2A2。 1为标准品，2为样品。 蛋白质的内源荧光 来自芳香族氨基酸，主要是色氨酸和酪氨酸。（280nm激发光，最大荧光在313nm（酪氨酸）和350nm（色氨酸）） A类蛋白无色氨酸，最大荧光发射波长304nm，来自酪氨酸，且位置不受大分子构象变化影响。 B类蛋白质含酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸，最大荧光发射在320－350nm范围，位置和量子产率都与环境有关，受构象影响。 蛋白质的外源荧光 荧光染料可与蛋白质共价结合，使蛋白分子带上特定的荧光性质，称为荧光探针。其对环境极性很敏感，在非极性环境中荧光很强，在极性溶剂中很弱。由其在各蛋白质分子中的荧光峰位、谱宽及量子产率可探测结合区的极性，获得构象信息。 苯胺萘磺酸染料是常用的荧光探针，氨基酸（蛋白质）结合后形成DNS－氨基酸（dansyl－氨基酸），具有相应荧光特性。 荧光分析（续） 荧光胺是用于探测氨基状态的荧光探针，可以和氨基酸迅速反应，灵敏度很高。 荧光素醋酸汞用于用于探测二硫键：在1mol/L的NaOH中其荧光被二硫键淬灭。 荧光标记蛋白质后，测定其荧光偏振可以了解和辅基、底物、抗原等的结合程度。结合越紧荧光偏振越大。也可以用于探测聚合和解离状态。 能量转移 带荧光基团的给体分子吸收能量后激发，无受体存在时发射荧光返回基态。附近有受体时可将能量转移给受体，受体激发后可能发射自己特征荧光，称敏化荧光；也可能放热不发荧光，称荧光淬灭。 转移效率和两基团距离相关，可以测定分子（基团）间距离。 3. 园二色谱（CD谱） 园二色谱是利用不对称分子对左、右园偏振光吸光不同进行结构分析的方法。 蛋白质的二级结构：螺旋，折叠，转角，无规卷曲具有不同的对称性，因而可利用CD谱测定蛋白质的二级结构，从而也可测定构象变化。 互相垂直的平面偏振光，振幅相等位相差π/2时合成为园偏振光，右手螺旋旋转的称右偏振光，左手螺旋旋转的为左偏振光。 园二色性的关系式 椭圆度：θλ = 0.25（ AL-AR ）d A为偏振光振幅，d为介质长度。 比椭圆度：[φ] λ = θλ / c d C为介质浓度。 摩尔椭圆度：[θ] λ = [φ] λ M/100 [θ] λ = 3300 Δε λ Δε λ为偏振光吸收差。 园二色谱与二级结构 左、右园偏振光进入含不对称分子的光学活性物质时，被吸收程度不同，因而从介质出来的光是椭园偏振光。其吸收差和波长有关。 吸收差或椭园度可用园二色仪测定。椭园度与波长的关系称园二色谱，各种二级结构有不同的园二色谱和特征峰位，因而园二色谱可用于测定二级结构。CD谱对二级结构变化很灵敏，常用于监测构象变化。 二级结构计算 单值法计算α螺旋（残基百分比）： fα=([θ]208-4000)/(33000-4000) 全值计算二级结构： fα ＋ fβ ＋ fR ＝1 [θ] λ = fα[θ] λ, α + fβ[θ] λ, β + fR[θ] λ,R 假设一系列λ处的fα，fβ，fR值，计算得到[θ] λ对λ曲线，和测定结果比较，取拟合最好的数值。 4. 红外光谱(RTIR) 蛋白质在红外区表现8个特征基团频率。 酰胺基团红外光谱 红外光谱用于分析蛋白质二级结构已进入定量阶段。 最常用于二级结构分析的是酰胺I带，位于1600－1700cm-1范围。 碳氧和氮氢间的氢键决定酰胺I带振动频率，反映特定二级结构。 1986年Byler和Susi用二阶导数和去卷积法分析，给出了各构象的特征酰胺I带位置，确定了各子峰的归属。 水溶液中酰胺I带特征频率指