整合子—耐药基因盒系统介导食源微生物耐药机制的研究-study on the mechanism of integron - drug resistance gene box system mediating food-borne microorganism drug resistance.docx

…-一 -一 摘要 摘要 食品的质量和安全问题是全球普遍关心的焦点。食源性疾病作为威胁人类健 康的 一类疾病己经引起相关研究人员的注意。沙门氏菌是引起食物中毒的 一类重 要的病原微生物，由于人类在临床上和畜牧养殖业中滥用抗生素，在过去的 10 年中，沙门氏菌的耐药性也呈现越来越严重的趋势。细菌的耐药机制，传播耐药 性质粒和转座子的研究比较多。近年，整合子-耐药基因盒系统成为研究人员关 注的热点，其对细菌耐药性的介导作用已经得到逐步的确认，其中，第一类整合 子对介导细菌的耐药性具有更重要的的意义。 为了探讨第一类整合子在食源性细菌耐药机制中的介导作用量对来自广州市 健康食品从业人员分离到的 23 株沙门氏菌做第一·类整合子的筛选。首先研究了 它们对 10 种常用抗尘素耐药性情况。结果表明所有的菌株对其中至少 一种抗生 素产生耐药。应用 PCR 法和菌落杂交方法检测第一类整合子，发现 4 株第一类整 合子阳性菌株，以 IN-F 和 IN-B 对其整合的耐药基因盒进行扩增，并对扩增片段 进行序列分析。结果表明，在 4 株第一类整合子阳性菌株中， 2 株各产生 一 个 1009bp 片段， 1 株产生 一个 1664bp 片段， 1 株产生 1009bp 和 1664bp 两个片段。 序列分析结果表明， l009bp 为 aadA2 耐药基因盒，对链霉素和壮观霉素产生耐药。 1664bp 含有 aadA5 和 dfr17 两个耐药基因盒，分别对链霉素、壮观霉素和甲氧氨 节目密 l应耐药。 为了研究第一类整合子的基因定位及其拷贝数，进行了 Southern 杂交实验和 质粒接合实验。选择在第 一一 类整合酶基因 intfl 无酶切位点的 EcoR 1 和 EcoRV 对染色体 DNA 进行限制性酶切，酶切后的染色体 DNA 和质粒 DNA 分别与 PCR 产生 的并由地高辛标记的 intfl 探针进行杂交，在质粒 DNA 上无杂交信号。同时在质 粒的接合转移实验中无接合子产生，说明了第一类整合子不存在于质粒 DNA 上。 而染色体 DNA 的杂交实验表明了第一类整合子的位置和拷贝数 ，S. tshiongwe S14 和 S tshiongwe S126 为 2 个拷贝 ，S. tshiongwe S 191 和 s. hadar S87 为单 拷贝。 以 4 株第一类整合子阳性菌株和 4 株整合子阴性菌株为研究对象，用任意引 物 PCR CAP-PCR) 和肠杆菌 f时间隔重复序列 PCR (ERIC-PCR) 两种方法测定 DNA 指纹图谱，来分析菌株第 类整合子的特性与基因分型之间的关系。两种方法对 实验菌株确定出统一并与第一类整合子特性相关的基因型，而 AP-PCR 方法较 ERIC-PCR 方法比较，在区分离体基因型方面能力更强。 为研究第一类整合酶基因对耐药基因盒捕获和表达的调控因子和调控过程， 采用了反向 PCR 方法扩增第一类整合酶基因上游未知的 DNA 片段。用 HindIII 对 S. tshiongwe 5191 染色体 DNA 进行限制性酶切，酶切 产 物自身环化。设计第一 华南理工大学工学博女学位论文 类整合酶基因的反向寻|物，扩增第一类整合酶上游未知 DNA 片段，产生 1502bp 大小的 DNA 片段，将该片段克隆到 pGEM 上，转化大肠杆菌，筛选转化子 p 提取 质粒后对其测序。序列分析的结果表明，在第一类整合酶上游未知 DNA 序列的 1052bp 大小的片段中，含有两个解离酶结合位点和一个开放阅读框，推测该开放 阅读框可能为第一类整合酶基因的调控因子。 本论文研究了第一类整合子介导的食源性微生物的耐药特性，提示我们应该 全面对细菌的耐药性进行监测。同时，本论文的数据对细菌耐药基因的控制和表 达的研究奠定了基础，也为控制致病菌的耐药性传播提供了研究思路。 关键词 z 整合子耐药基因盒整合酶沙门氏菌 11 ABSTRACT Abstract Throughout the world food safety and quality is a topic of public concern and well publicized. Widespread food borne disease outbreaks have created an awareness of potentia1 threats to human health. Salmonella species are an important group of bacterial pathogen in human. More and more