河北农业大学生物分离工程第三章 细胞分离及胞内产物的溶解.ppt

第三章微生物细胞破碎 生物分离过程的一般流程 概 述 微生物代谢产物大多分泌到细胞外，如大多数小分子代谢产物，以及细菌产生的碱性蛋白酶、霉菌产生的糖化酶、淀粉酶等等，称为胞外产物。 但有些目的产物存在于细胞内部，如大多数的酶、蛋白、类脂等，称为胞内产物。 自80年代以来，基因工程广泛应用，许多具有重要价值的生物产品应运而生，如胰岛素、白细胞介素、干扰素等。许多基因工程产物都是胞内产物，分离提取这些产物时，首先必须将细胞破碎，使产物释放，才能进一步提取分离。 因此，破碎技术已引起了基因工程专家和生化工程专家的极大关注。 概 述 细胞破碎（cell rupture）技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。 细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。 为了研究细胞破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微生物细胞壁的组成和结构。 3.1 细胞壁结构对破碎的影响 微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。 通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。 不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。 细菌细胞壁结构 细菌细胞壁结构 破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度。 革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很大不同。 革兰氏阴性菌典型的生物是大肠杆菌，通过这种细胞生产了很多细胞重组的产物。 酵母细胞壁的结构示意图 真菌的细胞壁 真菌的细胞壁较厚，主要由多糖组成，其次还含有较少量的蛋白质和脂类。 不同的真菌，细胞壁的组成有很大的不同，其中大多数真菌的多糖壁是由几丁质和葡聚糖构成，少数含纤维素。 与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。 红面包霉菌细胞壁具有同心圆层状结构主要存在三种聚合物 最外层(a)是α-和β-葡聚糖的混合物， 第2层(b)是糖蛋白的网状结构 第3层(c)主要是蛋白质， 最内层(d)主要是几丁质。 3.2 细胞破碎技术 一、机械法 机械破碎法又可分为 高压匀浆破碎法（homogenization） 高速珠研磨破碎法（bead grinding） 超声波破碎法（ultrasonication） 高压匀浆器的种类 高压匀浆器的种类较多： WAB公司的AVP Gaulin 31MR型 Bran and luebbe 公司SHL40型 意大利Niro Soavi 高压匀浆法使用时注意事项 高压匀浆器的操作温度上升约２-３℃/10MPa为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在20℃左右。 可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式。 在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。 高压匀浆法适用的范围 —大规模细胞破碎的常用方法 ☆高压匀浆法适用的范围： 酵母和大多数细菌细胞的破碎； 料液细胞浓度可以很高，20%左右。 ☆不宜使用高压匀浆法。 易造成堵塞的团状或丝状真菌， 较小的革兰氏阳性菌， 含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀） 影响高压匀浆器细胞破碎因素 被破碎的细胞分率符合如下公式： ln[1/(1-R)]=KNPɑ R — 破碎率，为N次循环后，蛋白质的释放量Rn与最大释放量Rm之比； K － 与温度有关的速度常数； P － 操作压力，MPa； ɑ － 与微生物种类有关的常数。 升高压力有利于破碎， 减少细胞的循环次数，甚至一次通过匀浆阀就可达到几乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小。 但p大到一定值时对匀浆器的磨损增加，也有实验表明p超生一定值时，R增加但很慢。 在工业生产中，通常采用的压力为55－70Mpa。 破碎性能还随菌体种类和生长环境的不同而不同 大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎， 生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养基上容易破碎。 高压匀浆法 X-挤压器 改进的高压方法：将浓缩的菌体悬液冷却至-25℃至-30℃形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。 细胞破碎是由于冰晶体在受压时的相变，包埋在冰中的细胞变形所引起的。 主要用于实验室中。 优点是适用的范围广，破碎率高，细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高 对冷冻-融解敏感的生化物质不适用。 2）珠磨法 bead mill 珠磨是常用的方法 细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌