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贴壁细胞培养过程中支原体污染几种救治方案疗效比较研究 　　文章编号：1009-5519(2008)08-1221-02　中图分类号：R446　文献标识码：B 　　 　　支原体是细胞培养中最常见、不易被察觉和干扰实验结果的污染物，约有30.3％～50.5％的细胞培养物中有支原体污染。培养细胞中支原体污染的来源包括：所使用的动物来源的一些产品如血清或已被支原体污染的细胞株系。细胞培养上清液中支原体的浓度可达107个/ml，而培养的细胞看起来很正常，在肉眼观察或普通光学显微镜下观察，受污染的细胞可无明显变化。由于竞争营养及支原体有毒的代谢产物，支原体污染可显著影响培养细胞的生理活性，使研究结果的真实性和可靠性大大下降。本实验拟使用4种方案处理体外培养的支原体污染贴壁细胞，并就其疗效进行比较，现报道如下。 　　 　　1 材料 　　 　　1．1 试剂及动物：(高糖)DMEM培养基：Giboco；胰蛋白酶：Gi-boco；DNA荧光法染色检测支原体试剂盒：Epitomics；BM-Cy-din：Roche；Bab/c裸鼠：北京动物所。 　　 　　1．2 细胞的来源和培养：人乳腺癌MCF-7细胞株，购自四川大学华西医学中心分子遗传学研究室。体外于不加抗生素的内含10％小牛血清的DMEM培养基，37℃、5％CO2恒温培养箱中培养。 　　 　　2 方法 　　 　　实验分为试验组、阳性对照组和阴性对照组。试验组为支原体污染且用不同方法作用的细胞，阳性对照组为支原体污染常规培养未作特殊处理的细胞，阴性对照组为常规培养支原体未污染的正常细胞。 　　 　　2．1 支原体污染检测：被检细胞接种在无菌的6孔细胞培养板中，接种密度为2×10O4/ml。5天后，先吸去培养液，再加入1ml的固定液，静置20min，吸去固定液，风干10min。于每孔中，加入lml的Hoechst33258工作液，37℃，20min。吸去Hoechst 33258工作液，风干后加入1滴封固液，并以盖玻片覆盖。用400x荧光显微镜观察细胞。 　　 　　2．2 支原体污染清除：试验组细胞按5×104/ml密度接种于25ml培养瓶内。利用各种方法作用后，检测支原体污染情况。阴性对照组及阳性对照组用不加抗生素的含10％小牛血清的DMEM培养基在37℃、5％CO2恒温培养箱中培养。 　　2．2．1 加温法：试验组细胞放入41℃温箱内，分别在8h、12h、16h、24h及48h末进行支原体的检测。 　　2．2．2 多西环素、环丙沙星联合排除法：多西环素和环丙沙星联合用药，试验组分为3组，两种药物用量分别为30μg/ml，50μg/ml和100μg/ml，培养24h、36h、48h末进行支原体的检测。 　　2．2．3 BM-Cyclin-1、2排除法：细胞传代同时加BM-Cychn-l10μg/ml，37℃培养3天；胰蛋白酶消化、传代，加入BM-Cyclin-25μg/ml，37℃培养3天；继续传代追加BM-Cychn-2 5μg/ml次，培养2～4天弃药液，D-Hanks液洗2次，胰蛋白酶消化传代，进行常规培养。 　　2．2．4 裸鼠过继法去除支原体闯：将支原体污染的细胞用0，25％胰酶，0.02％EDTA消化制成单细胞悬液后用PBS洗涤离心2次，调细胞密度至107个/ml；经小鼠背部皮下接种0.2ml细胞约10～15天后即可形成移植瘤；3～4周后无菌条件下取出移植瘤组织，剔除坏死部分，用注射器针芯在200目筛下将组织压碎使细胞释放人含0.1％EDTA的无血清DMEM培养液中：将细胞悬液小心加入含有淋巴细胞分离液离心管上层，室温下水平离心3000r/min，20min；用吸管吸出两种液体界面层的细胞置无血清DMEM培养液中，计数细胞；于无血清DMEM将细胞洗涤离心1次，用完全培养液调细胞密度至5×105个/ml，置37℃，5％CO2培养箱中培养。 　　 　　3 结果 　　 　　3．1 阴性对照组和阳性对照组：阴性对照组细胞经Hoechst33258荧光染色后，仅细胞核显色，细胞表面及细胞周围干净、清晰，无荧光小点。阳性对照组经Hoechst33258荧光染色后，可见细胞核与细胞膜及其周围均可见散在的蓝色荧光颗粒，其密集程度与污染呈正相关。 　　 　　3．2 加温对支原体污染的治疗效果：经观察发现，加温8h后，荧光小点开始变少。16h细胞周围支原体几乎消失。进入24h开始细胞周围的荧光小点完全消失，但细胞开始逐渐变圆。脱落飞48h大部分细胞已完全变圆，细胞正常形态消失，培养基中出现飘浮死亡细胞。 　　 　　3．3 多西环素、环丙沙星联合治疗支原体的效果：30μg/ml组和50μg/ml组多西环素和环丙沙星作用细胞24h开始，荧光开始减少