金钗石斛提取物抗白内障体外实验研究.docVIP

金钗石斛提取物抗白内障体外实验研究 　　摘要：目的：研究金钗石斛(Dendrobium nobile Lindl，)总生物碱和粗多糖对白内障的抑制作用。方法：采用溶剂法分离提取金钗石斛总生物碱和粗多糖；DMEM低糖培养基体外培养ICR大鼠晶状体，将晶状体分为7个组，分别在培养后6、12、18、24h共4个时段于解剖显微镜下观察并记录晶状体混浊度的改变；检测晶状体水溶性蛋白、谷胱甘N(GSH)的含量及总超氧化物歧化酶(T SOD)和丙二醛(MDA)的活性。结果：在培养的各个时段，正常对照组晶状体始终保持透明，各药物组晶状体混浊度与模型组相比明显较轻(P 　　关键词：金钗石斛；白内障；氧化损伤；晶状体 　　中图分类号：R285.5　文献标识码：A 　　文章编号：1007--2349(2009)09--0057--03 　　 　　白内障(cataract)是眼睛内晶状体发生混浊由透明变成不透明，阻碍光线进入眼内，从而影响了视力。初期混浊对视力影响不大，而后渐加重，明显影响视力甚至失明。在世界范围内白内障是致盲的首要病因，现在世界上大约有2千万人是由于白内障而致盲，另有1亿白内障患者需要手术恢复视力，在大多数的非洲和亚洲国家，白内障至少占盲人的一半。据我国调查的结果，白内障也是我国引起失明的最主要的眼病。当前许多中药研究都是从提高晶状体抗氧化能力人手，利用抗氧化剂或抗氧化酶激活剂来消除或中和晶状体中的氧化产物，阻止或逆转晶状体变浑浊，从而抑制或延缓白内障的发生发展。石斛是一种名贵中药材，抗白内障是其主治功效之一。已有研究证实，石斛水煎剂可通过改变晶状体相关酶的活性而对D半乳糖性白内障起到防治作用，石斛的乙酸乙酯提取物在体外还可抑制醛糖还原酶和过氧化脂质(LPO)的产生，这些研究在一定程度上揭示了石斛抗白内障的作用机理。然而，石斛化学成分复杂，其抗白内障的具体有效成分是什么，至今仍未见报道。本实验通过体外培养晶状体，对金钗石斛(Dendrobium nobile Lindl，)的粗提物总生物碱(totalalkaloids)和粗多糖(polysaccharides)抗白内障作用进行了探讨。 　　 　　1　材料和方法 　　 　　1，1试验材料动物SD清洁级大鼠，雌雄不限，4～5周龄，体重(80～120)g，共计20只。由昆明医学院动物房提供，合格证号：滇实验动物证第2005035号。 　　药材和试剂：金钗石斛由云南鸿翔药业有限公司提供；DMEM低糖培养基(上海玉博生物科技有限公司)；胎牛血清(长春西诺生物科技有限公司)；磷酸盐缓冲液(PBS，上海贝基生物科技有限公司)；体积分数30％过氧化氢(H2O2，浙江临安化工二厂)；吡诺克辛钠滴眼液(武汉五景药业有限责任公司，批号；070202)；Bradford蛋白质定量试剂盒(上海申能博彩生物科技有限公司)；谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)测定试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品；其他试剂均为国产分析纯。 　　试剂配制改良碘化铋钾试剂：甲液：0.85g次硝酸铋溶于10mL冰醋酸，加水40mL；乙液：8.g碘化钾溶于20mL水中；将甲液与乙液等量混合后，取1mL与2mL醋酸混合，供生物碱的显色用。Molish试剂：甲液：a萘酚1g，加75％乙醇至10mL；乙液：浓硫酸；作为多糖的检测用。 　　仪器RⅡ型旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)；SHZ IliA型循环水式多用真空泵(上海豫康科教仪器设备有限公司)；BSllOS型电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司)；HI-98128型pH计(北京HANNA)SW CJ IF型超净台(苏州净化设备厂)；Galaxy s型C02培养箱(美国RS Biotech)；ST PT型解剖显微镜(日本OLYMPUS)；PRISMTMR型低温高速离心机(美国Labnet)；7200型分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司)。 　　 　　1，2试验方法1，2，1金钗石斛总生物碱和粗多糖的分离提取及检识金钗石斛总生物碱和粗多糖的提取方法：干燥金钗石斛切碎打成粗粉，加入95％乙醇85℃回流提取(4.5h／次×3次)，合并提取液，减压回收乙醇后得到石斛浸膏，加1mol／L HCL调节浸膏的pH为3，氯仿萃取3遍后，弃氯仿层，加浓氨水调母液pH＝11，再经氯仿萃取3遍，将氯仿层合并，减压浓缩，挥干氯仿后即得到总生物碱。将醇提后的药渣晒干后加人20倍体积的水，100℃回流提取(3h／次×4次)，合并提取液，减压浓缩后，加入95％乙醇，直至醇浓度为70％，置于冰箱内，隔夜取出沉淀用无水乙醇和丙酮各洗涤3遍，再经Sevag法除蛋白处理，冷冻干燥，得到粗多糖。总生物碱的检识参照文献：取少量分离所得的总生物碱于试管内，加入蒸馏水和少许