一分钟整体卵白液相色谱法的建立.pdfVIP

摘要 蛋白质组学、蛋白药物和来自动植物等天然产物中的蛋白的分离和纯化的研究都需 要液相色谱法快速分离技术。PeterCarr小组最近提出快速分离的目标：一维液相色谱 分离要在1～10min内完成，二维液相色谱分离要在10～100rain内完成。尽管这个建 议是针对多肽提出的，但是也可以作为整体蛋白快速分离的目标。在本文中，利用蛋白 质在液．固界面的不连续迁移和色谱饼这种柱技术，首次建立了一分钟整体蛋白液相色 谱法。一般的快速分离仅仅包含了蛋白分离过程，而一分钟整体蛋白液相色谱在1min 内完成分离过程和色谱饼再生过程。分别用标准蛋白检测了反相色谱法、离子交换色谱 法和疏水相互作用色谱法三种模式的一分钟整体蛋白液相色谱法，蛋白质分离度没有明 显地损失。除了分离速度快分离能力强，该技术还有负载量高的优点。 论文包括了以下6个部分： 1．绪论 说明了色谱法快速分离的意义。介绍了一维快速分离蛋白质的方法，包括非多孔固 定相、整体固定相、灌注色谱法、高温快速液相色谱法和色谱饼法；还介绍了二维色谱 快速分离蛋白质的方法，包括了常规的使用多根不同机理色谱柱的二维液相色谱法 2．多孔反相填料对整体蛋白的高速、高分离度和高负载量分离 mm ITllTl×10 使用侧孔装填技术把3岬的C18反相多孔填料装填在超薄色谱饼(1 I．D．，78“L)中，用于7种标准蛋白混合物的分离。首次比较了小柱床体积的色谱饼和 ITLrn×4．6IIlIn 大柱床体积的色谱柱(50 I．D．，830 IlL)分离小分子和整体蛋白的效果。由 于小分子在色谱柱(饼)床上的迁移是连续的，导致色谱饼分离小分子的效果远远差于 色谱柱。而蛋白质在液．固界面存在“粘附能”，使得蛋白质在色谱柱(饼)床上的迁移 是不连续，造成色谱饼分离蛋白质的效果与色谱柱相当。由于色谱饼内径大柱长短的特 殊结构，其动力学性质远好于色谱柱，可以在高达10mL／min的流速下使用。在优化条 件下用色谱饼在30s内分离了7种蛋白。在5min内连续5次快速分离蛋白质。表明当 固定相和蛋白质之间的作用力是非选择性作用力时，一分钟整体蛋白液相色谱法是可以 实现的。在1min内还基线分离了总量是l mg的7种蛋白的混合物，实现了高速、高 分离度和高负载量的“三高”效果。该方法有希望用于临床例行分析。 3．多孔弱阳离子交换填料对整体蛋白的“三高分离 T 比较了两种弱阳离子交换商品填料TSKgel nm)更适合实现一分钟整体蛋白液相色谱法。 填料PolyCATA(粒径，31im；孔径，150 rnnl×10rain mm×4．6aim A色谱饼(1 I．D．)和色谱柱(50 I．D．)的分离能力 PolyCAT 相当。然而，色谱饼的动力学性质更好。在优化的条件下，在18s内分离了4种标准蛋 min内连续进 白。分离速度比整体固定相和无孔填料都要快，分离效果也更好。在10 行了10次的蛋白分离，证明了当固定相和蛋白质之间的作用力是静电相互作用力时， min内快速分离 也可以实现一分钟整体蛋白液相色谱法。另外用PolyCATA色谱饼在1 了总量lmg的4种蛋白混合物。 4．无孔疏水填料快速分离整体蛋白 mill×10ranl IIIlTI×