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光合细菌中氢化酶分离纯化及其性质研究 　　摘要:以光合细菌为出发菌株，离心得到的菌体经超声破碎后，得到的粗酶液经硫酸铵沉淀、透析、DEAE-52 离子交换层析和Sephadex G-200分子筛凝胶层析分离纯化获得电泳纯的氢化酶,且该酶的分子量为 62.0 ku和37.0 ku的两个亚基组成的分子量为99.0ku的二聚体,对该酶进行酶学性质的研究得到酶催化最适温度和pH值范围分别为30-℃和pH =7.5,且在25~35-℃和pH =7.0～8.0范围内催化放氢活力较稳定. 　　关键词:光合细菌；氢化酶；分离纯化 　　中图分类号:O629.8 文献标识码:A文章编号:1672-8513(2010)01-0046-03 　　Purification and Characterization of the Hydrogenase 　　Extracted from Photosynthetic Bacteria 　　LIANG Zhi?hua WANG Meng?liang 　　(Institute of Biotechnology, Shanxi University, Taiyuan 030006, China) 　　Abstract: 　　The purification and characteristics of an enzyme extracted from Photosynthetic Bacteria were studied. First, cells were disrupted by ultrasonic treatment. The hydrogenase was purified with a combination of ammonium precipitation, dialysis, DEAE-52 anion exchange chromatography and Sephadex G-200 gel filtration chromatography. The native molecular mass of the enzyme was found out to be the dimer of 99.0ku. The optimum pH and temperature for hydrogen production activity of the hydrogenase is 7.5 and 30 ℃. 　　Key words: 　　photosynthetic bacteria; hydrogenase; purification 　　 氢化酶是一类存在于微生物体内的重要生物酶,不仅能催化H2的氧化和质子的还原反应，而且在微生物的能量代谢中也起着重要的作用［1-2］.氢化酶潜在的应用价值被应用于实践生产的各个方面,例如氢的生产、生物治理、生物燃料和生物传感器等［3-4］. 　　1 材料与方法 　　1.1 菌种、试剂和仪器 　　菌种为本实验室保藏菌种类球红杆菌(Rhodobacter Sphaeroides). 　　DEAE-52 离子交换树脂、Sephadex G-200分子筛凝胶、柱层析系统(安玛西亚中国有限公司);聚乙二醇（PEG，20 000）;苯甲基磺酰氟(PMSF,Amresco);高速冷冻离心机(日立CR22G);冷冻真空干燥仪(美国Savant公司);超声破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司制造);紫外-可见分光光度计(日本岛津公司制造);电泳仪(Thermo EC120); 其它试剂购自上海化学试剂公司,均为市售分析纯或化学纯. 　　1.2 分离菌无细胞提取物的制备 　　将离心收集的菌体10-g，以1/3(g/mL)的比例，用10-mmol/L Tris-HCl(pH =7.5)缓冲液稀释成菌悬液，超声破碎10-min(工作2-s间歇3-s)，保持菌液始终处于低温0~4-℃.破碎后在-?8-000-r/min下冷冻离心10-min，所得上清液为粗酶液. 　　1.3 氢化酶的分离纯化 　　饱和度为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%和80%的硫酸铵进行分段盐析沉淀酶液，离心收集沉淀物，用Tris-HCl 缓冲液复溶.取盐析沉淀的粗酶液经透析浓缩后上DEAE-52 离子交换柱，进行洗脱，收集活性部分.将收集的活性部分透析后超滤浓缩上Sephadex G-200分子筛凝胶柱，进行洗脱，收集活性部分，透析后冻干浓缩贮存，检测酶纯度，用于酶学性质的研究. 　　1.4 氢化酶的酶活分析 　　氢化酶活力测定采用以甲基紫精(MV)为电子载体,Na2 S2O4为电子供体的放氢反应体系.放氢反应体系包括 30-mmol/L的Tri