ELISA简介课件.pptVIP

ELISA ELISA的原理 间接法ELISA 试剂准备： 包被液 结合物 酶和底物的准备 对照设定 结果判断 一ELISA的原理 ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的实验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法可有多种。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。 二间接法 间接法（图15-6）是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下： 　　（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。 （ 2）封闭 加入5%的脱脂牛奶200 　　（2）加稀释的受检血清/抗体：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。 　　（3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。 　　（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量/效价。 　　本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。 三ELISA的试剂 ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。 （1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）； （2）酶标记的抗原或抗体（结合物/二抗）； （3）酶的底物；A+B （4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品（一抗）； （5）结合物及标本的稀释液； （6）洗涤液（PBST)； 固相载体 聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。 聚氯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。 良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。 包被的方式 将抗原或抗体固定在固相载体过程称为包被(coating)。 蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质比较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。 不易吸附的非蛋白质抗原可用间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法。 包被的条件 pH9.6碳酸盐缓冲液 pH7.2的磷酸盐缓冲液 pH7-8的Tris-HCL缓冲液。 加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置过夜，37℃中保温2小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为10ng/ml-20ug/ml。 封闭 封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。 常用封闭剂：0.05%-0.5%的BSA; 10%的小牛血清或1%明胶;脱脂奶粉,比较价廉，可以高浓度使用（5%）。 所有的ELISA固相均需封闭？ 洗涤液 在板式ELISA中，常用的洗涤液为含0.2%吐温20磷酸盐缓冲液。 结合物 即酶标记的抗体（或抗原）是ELISA中关键的试剂 1 酶的催化活性 2抗体（或抗原）的免疫活性 3不含或少含游离的抗体（或抗原） 4结合物要有良好的稳定性。 酶 纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，受检标本中不存在相同的酶。 酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。 在ELISA中，HRP，AP，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。 HRP是一种糖蛋白，含糖量约为18%，分子量为44000，是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成，是一种卟啉蛋白质。 结合物的稀释液 用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上：0.1%牛血清白蛋白， 0.05%吐温20 。试剂盒均已用合适