PCR技术-王荣亮课件.ppt

Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应 PCR发明者 Kary B. Mullis (1944-) PCR的发展史 1. 1983年春，Mullis提出PCR的概念； 2. 1983年9月，Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做第一个PCR实验，只一个循环； 3. 1983年12月，同位素标记的10个循环后的49 bp长度的第一个PCR片断； 4. 1985年12月20日，Mullis的同事Saiki在Science上发了一篇论文，方法中用了PCR技术，导致Mullis的文章到处被拒； 5. 1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202 ），这回Mullis是第一发明人。 6. 1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界开始学习PCR方法； 7. 1986年6月，Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶，Taq DNA polymerase，这是1985年春天Mullis建议做的； 8. 1988年，第一台PCR仪问世； 9. 1991年，Hoffman LaRoche以3亿美元代价从Cetus公司获得全权开发权。 10.1993年，Mullis获得诺贝尔化学奖，PCR和DNA重组技术一样意义深远。 三篇重要论文 PCR仪的变迁 1. 三个水浴锅， 用手移动（Mullis等人当时用的） 2. 电加热块 ＋ 自来水冷却 （PE，1988） 3. 电加热块 ＋ 内置循环液冷却（PE，1989） 4. 三个加热块 ＋ 机械手（Stratagene，1994） 5. 半导体制冷和加热（MJ, PE, BioMetra, Eppendrof） 6. 温度梯度, 荧光检测 (如 Roche的Lightcycler) 7. 风加热 8. Lab-on-chip式的PCR仪(所谓的芯片PCR) 中国的状况 1991年出现三个水浴锅+机械手的原始PCR仪（华美，复日等） 现在以半导体（Peltier板）制冷式为主（杭州博日,上海天呈, 厦门安普利等） 变性：指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉 及共价键的断裂，不引起分子量的降低。 原理: 模板变性、引物退火、DNA 聚合酶进行DNA链延伸 特点：特异性、有效性、忠实性 1.操作简便省时； 2.灵敏度高； 3.特异性较强，但有一定的假阳性率。提高退火温度可以提高特异性； 4.对原始材料的质量要求较低； 5.有一定程度的单核苷酸错误掺入。因为Taq DNA聚合酶缺乏3’→5’核酸外切酶活性，不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入。 经典循环参数（500bp以内） 1) 长度一般为18-25个碱基； 2) 尽可能选择碱基随机分布的序列； 3) 两条引物的G+C的百分比应尽量相似，多为45~55%； 4) 避免引物内部形成二级结构； 5) 两引物之间不应发生互补，特别是在3′端（关键碱基）； 6) 引物3′末端碱基可以影响Taq酶的延伸效率，最好选T、G 或C，而非A； 7) 引物5′端允许有一段序列不与模板配对, 内切酶，保护碱基。 Primer Premier5.0引物设计 是由加拿大Premier公司开发的专业用于PCR或测序引物以及杂交探针的设计和评估的软件。 其主要界面分为序列编辑窗口（Genetank），引物设计窗口（Primer Design），酶切分析窗口（Restriction Sites）和Motif分析窗口。 Primer Premier5.0 可简单地通过手动拖动鼠标以扩增出相应片段所需的引物，而在手动的任何时候，显示各种参数的改变和可能的二聚体、异二聚体、发夹结构等。 也可以给定条件，让软件自动搜索引物，并将引物分析结果显示出来。 操作非常简单。 1) T=2×(A+T)+4×(G+C)-3~5 2) T=22+1.46 ln±3~5 ln=2(G or C)+(A or T) 20~35nt 3) T=81.5+16.6lg[J+]+0.41(G+C%)-(600/l)-0.63(FA%) [J+]=monovalent cations l=oligonucleotide length FA=formamide 14~70nt 4. 影响因素 模板：模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。一般100ng DNA模板/100?L。 引物：浓度不宜偏高，否则易形成引物二聚体和导致模板 与引物错配,反应特异性下降。 0.1-0.5 ?mol/L 。 dNTPs：过高易产生错误碱基的掺入,浓度