河北医科大学荧光定量pcr的原理与应用PPT.pptVIP

荧光定量PCR原理及其应用;;; 荧光定量PCR的定量原理;实时荧光定量PCR中的三个概念;阈值：PCR扩增信号进入相对稳定的指数增长期时的荧光信号值 (相当于公式Y= X ×（1+Ev）n中的Y) Ct值：阈值所对应的扩增循环数n(也就是公式Y= X ×(1+Ev)n中的n);Ct值与起始模板的关系 Y= X ×（1+Ev）n LgX =b(常数) – n*a (常数), n=Ct Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 ;;常用的荧光标记方法;第一代常规双链DNA内掺式染料： 溴化乙锭 (EB);第二代常规双链DNA内掺式染料：  SYBR? Green I;LC Green? I;5’;5’;优点： 可以应用于不同的模板，无需设计探针，使用方便 灵敏，便宜 缺点： 与非特异性产物结合，通过熔解曲线进行辨别;温度;将温度对荧光强度的变化求导。(-dI/dT) 峰值代表斜率改变最大时的温度值，即Tm，其值与双链DNA的长度、GC%含量有关，可部分代表序列的特异性 ;融解曲线分析，单一峰 无非特异性荧光 定量准确;常用的荧光标记方法;与目标序列互补;R;R;Oligo 1: Fluorescein;;基础研究中基因表达丰度的测定； 差异基因的表达检测，基因型分析； 临床医疗领域病原体的检测和基因诊断：包括特定基因的检测、细菌和病毒等病原体的检测； 环境监测，包括水质、空气的污染检验； 检验检疫工作：食品卫生检验，转基因作物的检验； 法医的遗传学鉴定； 新药的开发和研究。; 绝对定量（基因拷贝数的绝对定量） ; 相对定量 ;标准曲线 由系列稀释的已知浓度的样品做标准曲线 计算待测样品的初始模板浓度; 相对定量 ;定量分析——相对定量;待测组目的基因平均Ct值;使用??Ct法所要满足的条件：;某科研用户使用Rotor-Gene 3000进行基因表达相对定量分析，下图为用??Ct法得出的分析结果 。（自备标准品，检测样品做3次重复复管）;定量分析——相对定量;相对定量方法二——双标准曲线法; 优点：消除了由Ev差别而造成的误差，结果更为准确，分析简单， 实验优化简单 缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线;某科研用户使用Rotor-Gene 3000进行基因表达相对定量分析，下图为用双标准曲线法得出的分析结果 ;Comparative Delta-delta Ct法定量;Comparative Delta-delta Ct法定量;公式 ;特点及注意事项;将标准品进行梯度稀释后，分别对目的基因（Gene of Interest）和看家基因（Housekeeper Gene）做标准曲线。 ;分别对待测样品和对照样品的看家基因和目的基因进行扩增 。 ;将目的基因和看家基因分别编辑在两页中（page），并将同一样品命名成相同名称。 ;Page 2：目的基因，其中10-18号管通过YES选中，样品分别命名为A、B、C，其它未选中的样品可以不进行编辑。;;;;双标准曲线法定量;公式 ;特点及注意事项;1-6为目的基因的标准曲线，7-12为看家基因的标准曲线，待测样品A、B、C，其中15-17扩增了样品的看家基因，18-20扩增了样品的目的基因。;将所有目的基因编辑在一个page里，所有看家基因编辑在另一个page里，且相同的样品以同样名称命名。编辑完成之后即得：;进入Analysis，分别对page1和page2进行分析;依次选中目的基因的page、看家基因的page以及对照组（例，以A为对照组），按View Report显示分析结果 ，;;感谢各位老师对基因公司的支持！