浙江大学细胞工程第七章课件PPT.ppt

人为使得精子获能 可以利用自然交配法，即在交配后，由雌性生殖道回收精子。 而雌性生殖道获能没有种属特异性，因而可以由屠宰场取任何的动物的子宫或在实验室内取小动物的子宫给所需动物的精子获能。 另外，可以利用人工配制的培养液使得精子获能。 卵母细胞 人工采卵是得到卵母细胞的方法通常利用激素进行诱导采卵或超数采卵。可以利用促性腺激素或黄体激素释放激素（LH－RH），对小鼠、大鼠和兔子等动物进行一次性投与诱发其排卵，排卵数目不变。 以小鼠为例，通常可用3－5IU PMSG或2－3IU hCG或100μg FSH 或100μgLH或0.02－0.05μg LH－RH皮下或腹腔内注射，12－14小时可以有70％－100％正常排卵。 超数排卵 如果一次要获得多个卵，可以利用促性腺激素处理，使得卵巢中有更多的卵泡发育，更多的卵被排出，这个过程就称为超数排卵（superovulation） 如在小鼠Ⅳ－Ⅴ期涂片相时注射5－10IU PMSG，48－50小时后，再于皮下或腹腔注射5－10 IU hCG，这种方法可以获得超数排卵。 人的人工采卵和超数排卵，要在月经期5－9天，每天给予100－150mg 克罗米酚，11天或12天用B型超声检测卵巢表面的卵泡直径达到20mm时，再给予4000－9000 IU hCG，32－40小时后取卵。 采卵 输卵管内采卵：以鼠为例，一般为了防止干燥可将屠杀后取出的输卵管放在平皿内，用石蜡油覆盖，在实体显微镜下找到输卵管膨大不，用磨尖的钟表镊子，切开输卵管膨大部，使内容物溢出而找到卵。 对于稍大一些的动物可以用活体输卵管采卵，例如将兔子的腹部正中线切开，找出子宫角和输卵管。然后利用逆向冲卵法，自子宫输卵管连接处插入注射针，伞部以平皿接着冲洗；或在子宫输卵管连接处下1cm处，剪成V形小口，插入塑料细管，自伞部输卵管腹腔口插入，将液体推入，得到冲出的卵。 采卵 3. 对于屠宰场中的大中型动物，可以用注射器插入卵泡中抽取，或在手术后暴露卵巢，以注射器自卵泡中取卵。 4. 对人而言通常在超数排卵步骤处理后，用B超检测卵巢表面卵泡发育情况，然后，在腹腔后部体壁进行局部麻醉，将腹腔镜望远镜插管插入，以观察卵巢表面卵泡成熟情况，然后用套有聚四氟乙烯套管的吸卵针将卵吸出，放平皿中检查。 卵母细胞一般检测 得到卵母细胞后，可根据卵泡发育的不同时期，在显微镜下检查核和胞质发育的状况，如核的形态、位置和所处的时期。 排出的卵母细胞，有多层卵丘细胞包围，除去卵丘细胞后，可以见到卵周隙增大，内有第一极体，核处于第二次成熟分裂中期。 多数实验动物的卵母细胞胞质呈透明状，但由于胞质中富含大量脂滴和空泡，所以在镜下呈暗色。 各种不同的动物，按照不同的分类标准，卵的分类可以分为优秀、普通、不良和异常卵。 进行体外受精的卵母细胞，一般以卵丘卵母细胞复合体外面完整地包有3－4层卵丘细胞，卵母细胞胞质无斑块者为佳。 镜检卵母细胞 如果新鲜或固定后要作整体观察，可以取凡士林石蜡（1：1）融化后滴于载片中部四角，在镜下用微吸管自平皿中吸取卵母细胞，滴到4滴凡士林石蜡滴的中央，盖上盖片并轻压之，即可置于相差显微镜下观察。 如果要观察细节，需要染色、切片后观察。一般在卵固定后水洗染色，用琼脂与石蜡进行双重包埋，最后进行切片、脱腊和封固，进行观察。 7.23体外受精 体外受精（in vitro fertilization，IVF）就是将哺乳动物卵母细胞从母体取出，在体外进行精卵结合的过程。 主要包括：成熟或未成熟的卵母细胞获得、体外培养系统的建立、处理附睾内和射出精子、使精卵结合——受精、受精卵的体内或体外培养（in vitro culture，IVC）、移植妊娠和产仔 由于体外受精在实验室进行，所以得到的动物或人称为“试管动物”或“试管婴儿”。 历史 1951年Chang和Austin发现了精子的获能现象，为体外受精的实现打开了通路。 1954年，Thibault等获得第一只体外受精的兔子。随着研究深入，试管老鼠、试管猪、试管牛等相继产生。 1978年，Steptoe和Edwards制成了世界上的一例“试管婴儿”，至此，体外受精技术逐渐成熟。 过程 获得获能的精子和成熟的卵母细胞后，应在塑料平皿底部，用已经处理获能的精子浮游液5μl精子浮游液，注入小滴中，将成熟培养后的卵母细胞，或自体内手术冲出的卵母细胞，以BO液冲洗，用微吸管吸10个卵母细胞与少量BO液注入精子浮游液小滴中。在CO2培养箱中培养7小时后再经微量吸管自小滴中用BO液多次冲洗以洗去多余的精子。然后移入发育培养液（TCM－199＋10％FCS）继续培养。 显微操作协助受精 在显微操作仪下进行显微受精，即对哺乳动物的精子和卵母细胞，进行显微操作，促使其相互结合技术