荧光定量PCR专题报告PPT.pptVIP

SYBR Green 法 优缺点 对DNA模板没有选择性 ----适用于任何DNA 使用方便 -----不必设计复杂探针 非常灵敏 便宜 优 点 容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性 但可以通过熔解曲线的分析，优化反应条件 对引物特异性要求较高 缺 点 与目标序列互补 实时荧光定量PCR 方法2 ---TaqMan探针法 TaqMan---水解型杂交探针 5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针 每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光 TaqMan探针法 工作原理 实时荧光定量PCR 方法 3 Molecular beacon 法(分子信标) 标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补 茎由互补配对序列组成 环 茎 荧光素 淬灭剂 Molecular beacon (分子信标) 工作原理 FRET R Q R Q DNA模板 分子信标探针 荧光共振能量转移（FRET） 探针与DNA杂交时产生荧光 -----变性过程：产生非特异性荧光 -----延伸过程：不产生荧光 ------退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号 Molecular beacon (分子信标) 应用范围 起始模板的定量 基因型分析 产物鉴定 SNP（单核苷酸多态性）分析 Molecular beacon (分子信标) 优缺点 高特异性：对目标序列 检测SNP最灵敏的试剂之一 荧光背景低 优 点 只能用于一个特定目标 设计困难 价格比较高 缺 点 实时荧光定量PCR法 方法比较 方法 优点 缺点 适用范围 SYBR Green I 法 适用性广 灵敏 方便 便宜 引物要求高 易出现非特异性带 适合科研中对各种目的基因定量分析，基因表达量的研究，转基因重组动植物的研究 TaqMan 法 特异性高 重复性好 价格高 只适合特定目标 病原体检测，疾病耐药基因研究,药物疗效考核 遗传疾病的诊断 Molecular Beacon法(分子信标) 高特异性 荧光背景低 只适合特定目标 设计困难 价格高 特定基因分析 SNP分析 确定未知样品的 Ct值 通过标准曲线由未知样品的Ct值推算出其初始量 Sample 实时荧光定量PCR模板定量策略1－－绝对定量 25 实时荧光定量PCR中的标准曲线－－标准品 化学合成目的基因 将PCR扩增产物直接梯度稀释 已知拷贝数的质粒DNA和看家基因的RNA 纯度高，定量准确 受化学合成工艺限制， 只能合成120bp以下长度 方便、简单， 不准确、不稳定； 稳定，准确,可以校准目的基因表达水平 * Copyright ? 2003 Fair Isaac Corporation. All rights reserved. 植物荧光定量PCR技术 Real Time Quantitative PCR on Plants 主要内容 常规PCR技术简单回顾 实时荧光定量PCR技术的发展 实时荧光定量PCR技术的原理 实时荧光定量PCR技术常用方法 实时荧光定量PCR技术在植物上的应用 常规PCR技术简单回顾 1983 Cetus 公司的 K. Mullis在这年底（12月16日第一次成功实验）发明了PCR（Polymerase Chain Reaction，PCR） 。 1953-DNA 双螺旋结构 1958-DNA半保留复制 1971-体外扩增设想 1976-taq DNA聚合酶 1988- 1989-“分子年” 1993-诺贝尔奖 PCR? PCR只是一个简单的不起眼玩艺 ——凯利·穆利斯（Kary Mullis) PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的技术，后者又上升成为新的概念。 … 它最大的特点就是能不断推出新形式。 —— 摘自[Making PCR: A Story of Biotechnology by Paul Rabinow] 过去-----对基因进行定性 基因的差异表达最终决定着植物的形态建成------因此植物